પ્રારંભિક સામગ્રી: આરએનએ

ક્વોન્ટિટેટિવ ​​રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પીસીઆર (RT-qPCR) એ આરએનએનો પ્રારંભિક સામગ્રી તરીકે ઉપયોગ કરીને પીસીઆર પ્રયોગોમાં વપરાતી પ્રાયોગિક પદ્ધતિ છે.આ પદ્ધતિમાં, કુલ આરએનએ અથવા મેસેન્જર આરએનએ (એમઆરએનએ) પ્રથમ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ દ્વારા પૂરક ડીએનએ (સીડીએનએ) માં લખવામાં આવે છે.ત્યારબાદ, નમૂના તરીકે cDNA નો ઉપયોગ કરીને qPCR પ્રતિક્રિયા કરવામાં આવી હતી.RT-qPCR નો ઉપયોગ જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ, આરએનએ હસ્તક્ષેપ માન્યતા, માઇક્રોએરે માન્યતા, પેથોજેન શોધ, આનુવંશિક પરીક્ષણ અને રોગ સંશોધન સહિત વિવિધ પરમાણુ જીવવિજ્ઞાન કાર્યક્રમોમાં કરવામાં આવ્યો છે.

RT-qPCR માટે એક-પગલાની અને બે-પગલાની પદ્ધતિઓ

RT-qPCR એક-પગલાની અથવા બે-પગલાની પદ્ધતિ દ્વારા પરિપૂર્ણ કરી શકાય છે.વન-સ્ટેપ RT-qPCR રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને PCR એમ્પ્લીફિકેશનને જોડે છે, જે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને DNA પોલિમરેઝને સમાન બફર પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સમાન ટ્યુબમાં પ્રતિક્રિયા પૂર્ણ કરવાની મંજૂરી આપે છે.વન-સ્ટેપ RT-qPCR માટે માત્ર ક્રમ-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ જરૂરી છે.બે-સ્ટેપ RT-qPCRમાં, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને PCR એમ્પ્લીફિકેશન બે ટ્યુબમાં કરવામાં આવે છે, જેમાં વિવિધ ઑપ્ટિમાઇઝ બફર્સ, પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિ અને પ્રાઇમર ડિઝાઇન વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.

સંબંધિત વસ્તુઓ:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (એક પગલું)-SYBR ગ્રીન I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (એક પગલું)-તકમાન

ફર્સ્ટ-સ્ટ્રેન્ડ સીડીએનએ સિન્થેસિસ માટે RT સરળ I માસ્ટર પ્રિમિક્સ

રીયલ ટાઈમ પીસીઆર સરળ-SYBR ગ્રીન I કિટ

રીયલ ટાઈમ પીસીઆર ઈઝી-તકમાન

કુલ RNA અને mRNA ની પસંદગી

RT-qPCR પ્રયોગની રચના કરતી વખતે, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન માટે નમૂના તરીકે કુલ RNA અથવા શુદ્ધ mRNA નો ઉપયોગ કરવો કે કેમ તે નક્કી કરવું મહત્વપૂર્ણ છે.જો કે mRNA થોડી વધારે સંવેદનશીલતા પ્રદાન કરવામાં સક્ષમ હોઈ શકે છે, કુલ RNA હજુ પણ વારંવાર ઉપયોગમાં લેવાય છે.આનું કારણ એ છે કે કુલ આરએનએનો mRNA કરતાં પ્રારંભિક સામગ્રી તરીકે વધુ મહત્વનો ફાયદો છે.પ્રથમ, પ્રક્રિયાને ઓછા શુદ્ધિકરણ પગલાંની જરૂર છે, જે નમૂનાની વધુ સારી જથ્થાત્મક પુનઃપ્રાપ્તિ અને સેલ નંબરો શરૂ કરવા માટે પરિણામોના વધુ સારા સામાન્યીકરણની ખાતરી કરે છે.બીજું, તે mRNA સંવર્ધન પગલાને ટાળે છે, જે વિવિધ mRNA ની વિવિધ પુનઃપ્રાપ્તિને કારણે વિકૃત પરિણામોની શક્યતાને ટાળી શકે છે.એકંદરે, મોટા ભાગના કાર્યક્રમોમાં લક્ષ્ય જનીનનું સંબંધિત પ્રમાણ તપાસની સંપૂર્ણ સંવેદનશીલતા કરતાં વધુ મહત્વનું હોવાથી, મોટાભાગના કિસ્સાઓમાં કુલ RNA વધુ યોગ્ય છે.

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રાઈમર

બે-પગલાની પદ્ધતિમાં, સીડીએનએ પ્રતિક્રિયાને પ્રાઇમ કરવા માટે ત્રણ અલગ અલગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે: ઓલિગો(ડીટી) પ્રાઇમર્સ, રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ અથવા ક્રમ-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ.સામાન્ય રીતે, ઓલિગો(ડીટી) પ્રાઇમર્સ અને રેન્ડમ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ સંયોજનમાં થાય છે.આ પ્રાઇમર્સ ટેમ્પલેટ mRNA સ્ટ્રૅન્ડ સાથે જોડાય છે અને સંશ્લેષણ માટે પ્રારંભિક બિંદુ સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ પ્રદાન કરે છે.

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ એ એન્ઝાઇમ છે જે ડીએનએને સંશ્લેષણ કરવા માટે આરએનએનો ઉપયોગ કરે છે.કેટલાક રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટેસમાં RNase પ્રવૃત્તિ હોય છે અને ટ્રાન્સક્રિપ્શન પછી RNA-DNA હાઇબ્રિડ સ્ટ્રેન્ડ્સમાં RNA સ્ટ્રૅન્ડને ડિગ્રેજ કરી શકે છે.જો તેમાં RNase એન્ઝાઈમેટિક પ્રવૃત્તિ નથી, તો ઉચ્ચ qPCR કાર્યક્ષમતા માટે RNaseH ઉમેરી શકાય છે.સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા ઉત્સેચકોમાં મોલોની મ્યુરિન લ્યુકેમિયા વાયરસ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને એવિયન માયલોબ્લાસ્ટોમા વાયરસ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો સમાવેશ થાય છે.RT-qPCR માટે, ઉચ્ચ થર્મોસ્ટેબિલિટી સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ પસંદ કરવાનું આદર્શ છે, જેથી cDNA સંશ્લેષણ ઊંચા તાપમાને કરી શકાય, ઉચ્ચ ગૌણ માળખું સાથે RNA નું સફળ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સુનિશ્ચિત કરીને, સમગ્ર પ્રતિક્રિયા દરમિયાન તેમની સંપૂર્ણ પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખીને, ઉચ્ચ cDNA ઉપજમાં પરિણમે છે.

સંબંધિત વસ્તુઓ:

ફોરેસી M-MLV રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજની RNase H પ્રવૃત્તિ

RNaseH આરએનએ-ડીએનએ ડુપ્લેક્સમાંથી આરએનએ સ્ટ્રેન્ડને ડિગ્રેડ કરવામાં સક્ષમ છે, જે ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએના કાર્યક્ષમ સંશ્લેષણને મંજૂરી આપે છે.જો કે, ટેમ્પલેટ તરીકે લાંબા mRNA નો ઉપયોગ કરતી વખતે, RNA અકાળે અધોગતિ થઈ શકે છે, જેના પરિણામે cDNA કાપવામાં આવે છે.તેથી, જો લાંબા ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ્સનું સંશ્લેષણ ઇચ્છિત હોય તો cDNA ક્લોનિંગ દરમિયાન RNaseH પ્રવૃત્તિને ઓછી કરવી ઘણી વખત ફાયદાકારક છે.તેનાથી વિપરીત, RNase H પ્રવૃત્તિ સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ ઘણીવાર qPCR એપ્લિકેશન માટે ફાયદાકારક હોય છે કારણ કે તેઓ PCR ના પ્રથમ ચક્ર દરમિયાન RNA-DNA ડુપ્લેક્સના ગલનને વધારે છે.

પ્રાઈમર ડિઝાઇન

RT-qPCR માં qPCR સ્ટેપ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા PCR પ્રાઇમર્સ આદર્શ રીતે એક્સોન-એક્સોન જંકશનને ફેલાવવા માટે ડિઝાઇન કરવા જોઈએ, જ્યાં એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઈમર સંભવિતપણે વાસ્તવિક એક્સોન-ઇન્ટ્રોન સીમાને ફેલાવી શકે છે.ઈન્ટ્રોન-સમાવતી જીનોમિક ડીએનએ સિક્વન્સ એમ્પ્લીફાઈડ ન હોવાથી, આ ડિઝાઈન જીનોમિક ડીએનએને દૂષિત કરવાથી એમ્પ્લીફાઈડ ખોટા ધનનું જોખમ ઘટાડે છે.

જો પ્રાઇમર્સને એક્સોન્સ અથવા એક્સોન-એક્સોન સીમાઓને અલગ કરવા માટે ડિઝાઇન કરી શકાતી નથી, તો જીનોમિક DNA દૂષણને દૂર કરવા માટે RNA સેમ્પલને RNase-ફ્રી DNase I અથવા dsDNase સાથે સારવાર કરવી જરૂરી બની શકે છે.

RT-qPCR નિયંત્રણ

ડીએનએ દૂષણ (જેમ કે જિનોમિક ડીએનએ અથવા અગાઉની પ્રતિક્રિયાઓમાંથી પીસીઆર ઉત્પાદનો) શોધવા માટે તમામ RT-qPCR પ્રયોગોમાં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન નેગેટિવ કંટ્રોલ (-RT નિયંત્રણ) શામેલ હોવું જોઈએ.આ નિયંત્રણમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજ સિવાયના તમામ પ્રતિક્રિયા ઘટકોનો સમાવેશ થાય છે.આ નિયંત્રણ સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન થતું ન હોવાથી, જો PCR એમ્પ્લીફિકેશન જોવામાં આવે તો, DNA માંથી દૂષિત થવાની સંભાવના છે.