• ફેસબુક
  • લિંક્ડિન
  • યુટ્યુબ

PCR રીએજન્ટના પ્રારંભિક તબક્કામાં પ્રાઇમર્સ અને પ્રોબ્સની કામગીરીની ચકાસણી કરવી અને સૌથી યોગ્ય પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિ નક્કી કરવી એ ઔપચારિક પ્રયોગોની સરળ પ્રગતિની ખાતરી કરવા માટે પૂર્વજરૂરીયાતો છે.

તો આપણે કેવી રીતે પ્રારંભિક તબક્કામાં પ્રાઈમર પ્રોબની પુષ્ટિ કરવાની જરૂર છે?

મુખ્ય સૂચકાંકો બેઝલાઇન, એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ, સીટી મૂલ્ય, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા, ઓછી સાંદ્રતા નમૂના શોધ, સીવી વગેરે છે.

બેઝલાઇન

આધારરેખા એ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન કર્વમાં આડી રેખા છે.પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાના પ્રથમ થોડા ચક્રમાં, ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ વધુ બદલાતું નથી અને એક સીધી રેખા બનાવે છે.આ સીધી રેખા આધારરેખા છે.

પીસીઆર પ્રાઈમર પ્રોબ્સની તપાસ કરતી વખતે, બેઝલાઈન લેવલ છે કે કેમ તેના પર ધ્યાન આપો.પ્રાઈમર પ્રોબ એકાગ્રતાની શુદ્ધતા બેઝલાઈનને અસર કરશે, જેમ કે બેઝલાઈન વધવા કે ઘટવા માટે.આધારરેખા પણ ખૂબ જ સાહજિક સૂચક છે.
વિશ્લેષણ

એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ

અન્ય સાહજિક સૂચક એમ્પ્લીફિકેશન કર્વનો આકાર છે.ગૌણ એમ્પ્લીફિકેશન અથવા અન્ય અસાધારણ એમ્પ્લીફિકેશન વણાંકો ટાળવા માટે એસ આકારનો વળાંક હોવો શ્રેષ્ઠ છે.
નલ

સીટી મૂલ્ય

આધારરેખાથી ઘાતાંકીય વૃદ્ધિ સુધીના વળાંક બિંદુને અનુરૂપ ચક્રોની સંખ્યા એ Ct મૂલ્ય છે.

સમાન નમૂના માટે, વિવિધ પ્રાઈમર પ્રોબ્સ વિવિધ એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ્સમાં પરિણમે છે, અને અનુરૂપ Ct મૂલ્ય એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને હસ્તક્ષેપ ડિગ્રી દ્વારા પ્રભાવિત થશે.સિદ્ધાંતમાં, આપણે પસંદ કરીએ છીએ તે પ્રાઈમર પ્રોબનું Ct મૂલ્ય જેટલું નાનું છે, તેટલું સારું.

વિશ્લેષણ-3

એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા

PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટેની સૌથી વિશ્વસનીય અને સ્થિર પદ્ધતિઓમાંની એક પ્રમાણભૂત વળાંક છે, જે સંશોધકો દ્વારા પણ વ્યાપકપણે ઓળખાય છે.પદ્ધતિમાં લક્ષ્ય નમૂનાઓની સંબંધિત સંખ્યાને નિયંત્રિત કરવા માટે નમૂનાઓની શ્રેણી બનાવવાનો સમાવેશ થાય છે.આ નમૂનાઓ સામાન્ય રીતે સંકેન્દ્રિત સ્ટોક સોલ્યુશનના સીરીયલ ડિલ્યુશન દ્વારા બનાવવામાં આવે છે, સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતું 10-ગણું મંદન છે.પાતળું નમૂનાઓની શ્રેણીનો ઉપયોગ કરીને, પ્રમાણભૂત qPCR પ્રોગ્રામનો ઉપયોગ કરીને Cq મૂલ્યને વિસ્તૃત કરવા માટે, અને અંતે દરેક નમૂનાની સાંદ્રતા અને અનુરૂપ Cq મૂલ્ય અનુસાર રેખીય સમીકરણ Cq= -klgX0+b મેળવવા માટે પ્રમાણભૂત વળાંક દોરો અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા E=10(-1 /k1)-જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ માટે qPCR નો ઉપયોગ કરતી વખતે, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 90%-110% (3.6>k>3.1) ની રેન્જમાં હોવી જરૂરી છે.

વિશ્લેષણ-4

ઓછી સાંદ્રતાના નમૂનાઓની તપાસ

જ્યારે નમૂનાની સાંદ્રતા ઓછી હોય છે, ત્યારે વિવિધ પ્રાઈમર પ્રોબના શોધ દર અલગ હોય છે.અમે નકલ કરવા માટે 20 ઓછી સાંદ્રતાના નમૂનાઓ પસંદ કરીએ છીએ, અને સૌથી વધુ શોધ દર ધરાવતી પ્રાઈમર-પ્રોબ સિસ્ટમ શ્રેષ્ઠ છે.

વિશ્લેષણ-5

વિવિધતાના ગુણાંક (CV)

ન્યુક્લીક એસિડ એમ્પ્લીફિકેશન ડિટેક્શન માટે રીએજન્ટના લાઇન સ્ટાન્ડર્ડ અનુસાર અલગ-અલગ પ્રાઈમર પ્રોબ્સ સાથે 10 ડુપ્લિકેટ નમૂનાઓ શોધી શકાય છે.

વિશ્લેષણ-6

જથ્થાત્મક રીએજન્ટ્સ:
ચોકસાઈ
એક બેચની અંદરની ચોકસાઈ પૂરી થવી જોઈએ: પરીક્ષણ સાંદ્રતાના લઘુગણક મૂલ્યના વિવિધતાના ગુણાંક (CV,%) ≤5% છે.જ્યારે નમૂનાની સાંદ્રતા ઓછી હોય છે, ત્યારે શોધ સાંદ્રતાના લઘુગણકના વિવિધતાના ગુણાંક (CV,%) ≤10% છે


ગુણાત્મક રીએજન્ટ્સ:
ચોકસાઈ
એક બેચની અંદરની ચોકસાઈ પૂરી થવી જોઈએ:

(1) Ct મૂલ્ય (CV,%) ≤5% ની વિવિધતાનો ગુણાંક

સમાન નમૂનાનું 10 વખત સમાંતર પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે, અને પરીક્ષણ પરિણામો સુસંગત હોવા જોઈએ


પોસ્ટ સમય: સપ્ટેમ્બર-18-2021