ડાયરેક્ટ પીસીઆર એ એક પ્રતિક્રિયા છે જે ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ વિના એમ્પ્લીફિકેશન માટે પ્રાણી અથવા છોડની પેશીઓનો સીધો ઉપયોગ કરે છે.ઘણી રીતે, ડાયરેક્ટ પીસીઆર નિયમિત પીસીઆરની જેમ કામ કરે છે

મુખ્ય તફાવત ડાયરેક્ટ પીસીઆરમાં વપરાતા કસ્ટમ બફરનો છે, ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ વિના નમૂના સીધા પીસીઆર પ્રતિક્રિયાને આધિન કરી શકાય છે, પરંતુ ઉત્સેચકોની સહનશીલતા અને સીધી પીસીઆર પ્રતિક્રિયામાં સામેલ બફરની સુસંગતતા માટે અનુરૂપ આવશ્યકતાઓ છે.

સામાન્ય નમૂનાઓમાં વધુ કે ઓછા પીસીઆર અવરોધકો હોવા છતાં, પ્રત્યક્ષ પીસીઆર હજુ પણ ઉત્સેચકો અને બફરની ક્રિયા હેઠળ વિશ્વસનીય એમ્પ્લીફિકેશન હાંસલ કરી શકે છે.પરંપરાગત પીસીઆર પ્રતિક્રિયાને નમૂના તરીકે ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા ન્યુક્લીક એસિડની જરૂર પડે છે, જો નમૂનામાં પ્રોટીન અને અન્ય અશુદ્ધિઓ હોય તો પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની સરળ પ્રગતિને અટકાવી શકે છે.ડાયરેક્ટ પીસીઆર હાલમાં મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સના ક્ષેત્રમાં સૌથી વધુ લોકપ્રિય તકનીકોમાંની એક છે.

01 ડાયરેક્ટ પીસીઆરનો ઉપયોગ મૂળરૂપે પ્રાણી અને છોડ માટે થતો હતો

ડાયરેક્ટ પીસીઆરનો સૌથી પહેલો ઉપયોગ પ્રાણીઓ અને છોડના ક્ષેત્રમાં છે, જેમ કે ઉંદરના લોહી, પેશીઓ અને વાળ, બિલાડી, ચિકન, સસલું, ઘેટાં, ઢોર, વગેરે, છોડના પાંદડા અને બીજ વગેરે, જેનો ઉપયોગ જીનોટાઇપિંગ, ટ્રાન્સજેનિક, પ્લાઝમિડ ડિટેક્શન, જીન નોકઆઉટ સોર્સિસ, એસએનએઆઇડેન્ટ વિશ્લેષણ, એસએનએઆઇડેન્ટ ફિલ્ડ, ડીએનએ ઓળખાણના અન્ય અભ્યાસ માટે થાય છે. s

આ ક્ષેત્રોમાં કેટલીક સામાન્ય વિશેષતાઓ છે, એટલે કે, લક્ષ્ય જનીનનું પ્રમાણ પ્રમાણમાં વધારે છે અને ન્યુક્લીક એસિડનું નિષ્કર્ષણ મુશ્કેલીકારક છે, તેથી ડાયરેક્ટ પીસીઆર માત્ર સમય બચાવી શકતું નથી અને પરિણામો પર થોડી અસર કરી શકે છે, પણ ખર્ચ પણ બચાવે છે.

પેથોજેન શોધ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા ડાયરેક્ટ પીસીઆર એ તાજેતરના વર્ષોની વાત છે, કેટલાક પીસીઆર રીએજન્ટ ઉત્પાદકોએ નવીનતા કરતી વખતે આ દિશામાં ઘણા પ્રયત્નો કર્યા છે.ખાસ કરીને આ COVID-19 રોગચાળામાં, આવા ઘણા ડિટેક્શન ઉત્પાદનો બજારમાં દેખાયા છે, જેમ કે SARS-CoV-2 ન્યુક્લીક એસિડ ડિટેક્શન કીટ (મલ્ટીપ્લેક્સ પીસીઆર ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ મેથડ) ફોરજીન દ્વારા સંશોધન અને વિકસાવવામાં આવી છે, જે રિયલ-ટાઇમ RT PCR ટેક્નોલોજી (rRT-PCR) નો ઉપયોગ કરે છે. oropharyngeal swab નમૂનાઓ.

ફોરજીન એ ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેકનોલોજીનો ઉપયોગ કરતી કંપનીઓમાંની એક છે, જે સામાન્ય ORF1ab, N, E, અનેચલ માનવ નાસોફેરિંજલ અથવા ઓરોફેરિંજિયલ સ્વેબ નમૂનાઓમાં વંશાવલિ ન્યુક્લિક એસિડ્સ જેમ કે SARS-CoV-2 B.1.1.7 વંશ (યુકે), B.1.351 વંશ (ZA), B.1.617 વંશ (IND) અને P.1 વંશ (BR).

02  ડાયરેક્ટ પીસીઆર માટે જરૂરી રીએજન્ટ્સ

નમૂના Lysate

નમૂના lysate તમારા દ્વારા ગોઠવી શકાય છે અથવા ખરીદી શકાય છે.લિસેટની વિવિધ બ્રાન્ડની રચનામાં તફાવત લાયસિંગ ક્ષમતાને અલગ બનાવશે, અને પછી લિઝિંગનો સમય થોડો અલગ હશે.ઉદાહરણ તરીકે, પ્રાણીઓના પેશીઓના નમૂનાઓ તૈયાર કરવા માટે, સામાન્ય રીતે 30 મિનિટ અથવા રાતોરાત લિસિસની ભલામણ કરવામાં આવે છે, અને વાયરસ માટે લિસિસ સોલ્યુશન 3-10 મિનિટ સુધીની હોય છે.

પીસીઆર માસ્ટર મિક્સ

ચોક્કસ એમ્પ્લીફિકેશન વધારવા અને એમ્પ્લીફિકેશન ક્ષમતા વધારવા માટે હોટ-સ્ટાર્ટ ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.ડાયરેક્ટ પીસીઆરનો મુખ્ય ભાગ અત્યંત સહનશીલ પોલિમરેઝ છે.

ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશનને અસર કરતા નમૂનામાંના ઘટકોને દૂર કરો અથવા અટકાવો

નમૂનાને લાયસેટ સાથે પ્રક્રિયા કર્યા પછી, પ્રોટીન, લિપિડ્સ અને અન્ય સેલ કચરો મુક્ત કરવામાં આવશે, આ પદાર્થો પીસીઆર પ્રતિક્રિયાને અટકાવશે.તેથી, ડાયરેક્ટ પીસીઆરને આ પરિબળોના પ્રભાવને ઘટાડવા માટે અનુરૂપ નિરાકરણ અથવા અવરોધકો ઉમેરવાની જરૂર છે.

03  ડાયરેક્ટ પીસીઆરના પાંચ જ્ઞાન બિંદુઓનો સંગ્રહ

પ્રથમ, ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેકનોલોજી વિવિધ જૈવિક નમૂનાઓ માટે સીધી પીસીઆર ટેકનોલોજી છે.આ તકનીકી સ્થિતિ હેઠળ, ન્યુક્લીક એસિડને અલગ કરવાની અને કાઢવાની કોઈ જરૂર નથી, ટીશ્યુ સેમ્પલનો ઑબ્જેક્ટ તરીકે સીધો ઉપયોગ કરવો અને PCR પ્રતિક્રિયા કરવા માટે લક્ષ્ય જીન પ્રાઇમર્સ ઉમેરવાની જરૂર નથી.

બીજું, ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેક્નોલોજી એ માત્ર પરંપરાગત ડીએનએ ટેમ્પ્લેટ એમ્પ્લીફિકેશન ટેક્નોલોજી નથી, પરંતુ તેમાં આરએનએ ટેમ્પલેટ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પીસીઆરનો પણ સમાવેશ થાય છે.

ત્રીજું, ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેક્નોલોજી માત્ર ટીશ્યુ સેમ્પલ પર રૂટિન ગુણાત્મક પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓ જ સીધી રીતે કરે છે, પરંતુ તેમાં રીઅલ-ટાઇમ qPCR પ્રતિક્રિયાઓનો પણ સમાવેશ થાય છે, જેના માટે પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં મજબૂત એન્ટિ-બેકગ્રાઉન્ડ ફ્લોરોસેન્સ હસ્તક્ષેપ ક્ષમતા હોવી જરૂરી છે અને અંતર્જાત ફ્લોરોસેન્સ વિરોધી ક્ષમતાને શાંત કરે છે.

ચોથું, ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેક્નોલોજી દ્વારા લક્ષ્યાંકિત નમૂનાઓને માત્ર ન્યુક્લીક એસિડ ટેમ્પ્લેટ્સ છોડવાની જરૂર છે, અને પીસીઆર પ્રતિક્રિયામાં દખલ કરતા પ્રોટીન, પોલિસેકરાઇડ્સ, મીઠું આયનો, વગેરેને દૂર કરતા નથી.જેના માટે પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ન્યુક્લીક એસિડ પોલિમરેઝ અને પીસીઆર મિક્સ માટે ઉત્કૃષ્ટ પ્રતિકાર અને અનુકૂલનક્ષમતા હોવી જરૂરી છે જેથી જટિલ પરિસ્થિતિઓમાં એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ અને પ્રતિકૃતિની ચોકસાઈ સુનિશ્ચિત કરી શકાય.

પાંચમું, કોઈપણ ન્યુક્લીક એસિડ સંવર્ધન સારવાર વિના ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેક્નોલોજી દ્વારા લક્ષ્યાંકિત પેશી નમૂના અને નમૂનાની માત્રા ખૂબ જ ઓછી છે, જેના માટે પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં અત્યંત ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા હોવી જરૂરી છે.