ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR (જેને TaqMan PCR તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, ત્યારબાદ FQ-PCR તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) એ 1995માં યુનાઇટેડ સ્ટેટ્સમાં PE (પર્કિન એલ્મર) દ્વારા વિકસાવવામાં આવેલી નવી ન્યુક્લિક એસિડ જથ્થાત્મક તકનીક છે. આ તકનીક ફ્લોરોસન્ટ લેબલવાળા પ્રોફેશનલ ઉમેરીને પરંપરાગત PCR પર આધારિત છે.લવચીક PCR ની તુલનામાં, FQ-PCR તેના માત્રાત્મક કાર્યને સમજવા માટે ઘણા ફાયદા ધરાવે છે.આ લેખ ટેક્નોલોજીની લાક્ષણિકતાઓ, સિદ્ધાંતો, પદ્ધતિઓ અને એપ્લિકેશનોનું સંક્ષિપ્તમાં વર્ણન કરવાનો છે.

1 લક્ષણો

FQ-PCRમાં માત્ર સામાન્ય PCRની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા જ નથી, પણ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સના ઉપયોગને કારણે, તે માત્રાત્મક પરિણામો મેળવવા માટે ફોટોઈલેક્ટ્રીક વહન પ્રણાલી દ્વારા PCR એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલના ફેરફારને સીધી રીતે શોધી શકે છે, જે પરંપરાગત PCRની ઘણી ખામીઓને દૂર કરે છે, તેથી તે ઉચ્ચ ગુણવત્તાની ડીએનએ સ્પેસિફિકેશન ટેકનોલોજી અને ડીએનએ સ્પેસિફિકેશનની વિશિષ્ટતા ધરાવે છે.

ઉદાહરણ તરીકે, સામાન્ય પીસીઆર ઉત્પાદનોને એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અને અલ્ટ્રાવાયોલેટ પ્રકાશ સાથે એથિડિયમ બ્રોમાઇડ સ્ટેનિંગ અથવા પોલિએક્રાયલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અને સિલ્વર સ્ટેનિંગ દ્વારા અવલોકન કરવાની જરૂર છે.આને માત્ર બહુવિધ સાધનોની જરૂર નથી, પણ સમય અને પ્રયત્ન પણ લે છે.એથિડિયમ બ્રોમાઇડનો ઉપયોગ કરાયેલા સ્ટેન માનવ શરીર માટે હાનિકારક છે, અને આ જટિલ પ્રાયોગિક પ્રક્રિયાઓ પ્રદૂષણ અને ખોટા હકારાત્મક માટે તકો પૂરી પાડે છે.જો કે, FQ-PCR ને નમૂના લોડિંગ દરમિયાન માત્ર એક જ વાર ઢાંકણ ખોલવાની જરૂર છે, અને ત્યારપછીની પ્રક્રિયા સંપૂર્ણપણે બંધ-ટ્યુબ ઓપરેશન છે, જેને PCR પોસ્ટ-પ્રોસેસિંગની જરૂર નથી, પરંપરાગત PCR કામગીરીમાં ઘણી ખામીઓને ટાળીને.આ પ્રયોગ સામાન્ય રીતે PE કંપની દ્વારા વિકસિત ABI7100 PCR થર્મલ સાયકલનો ઉપયોગ કરે છે.

સાધનમાં નીચેની લાક્ષણિકતાઓ છે: ① વ્યાપક એપ્લિકેશન: તેનો ઉપયોગ ડીએનએ અને આરએનએ પીસીઆર ઉત્પાદન પરિમાણ, જનીન અભિવ્યક્તિ સંશોધન, પેથોજેન શોધ અને પીસીઆર પરિસ્થિતિઓના ઑપ્ટિમાઇઝેશન માટે થઈ શકે છે.② અનન્ય જથ્થાત્મક સિદ્ધાંત: ફ્લોરોસન્ટલી લેબલવાળી ચકાસણીઓનો ઉપયોગ કરીને, લેસર ઉત્તેજના પછી પીસીઆર ચક્ર સાથે ફ્લોરોસેન્સનું પ્રમાણ એકઠું થશે, જેથી પરિમાણનો હેતુ હાંસલ કરી શકાય.③ ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા: બિલ્ટ-ઇન 9600 PCR થર્મલ સાઇકલર, 96 નમૂનાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન અને પ્રમાણીકરણ આપમેળે અને સિંક્રનસ રીતે પૂર્ણ કરવા માટે 1 થી 2 કલાક નિયંત્રિત કમ્પ્યુટર.④ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસની જરૂર નથી: નમૂનાને પાતળું અને ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ કરવાની જરૂર નથી, ફક્ત પ્રતિક્રિયા ટ્યુબમાં સીધા જ શોધવા માટે વિશેષ ચકાસણીનો ઉપયોગ કરો.⑤પાઈપલાઈનમાં કોઈ પ્રદૂષણ નથી: અનન્ય સંપૂર્ણપણે બંધ પ્રતિક્રિયા ટ્યુબ અને ફોટોઈલેક્ટ્રીક વહન સિસ્ટમ અપનાવવામાં આવી છે, તેથી પ્રદૂષણ વિશે ચિંતા કરવાની કોઈ જરૂર નથી.⑥પરિણામો પુનઃઉત્પાદનક્ષમ છે: પરિમાણાત્મક ગતિશીલ શ્રેણી તીવ્રતાના પાંચ ઓર્ડર સુધીની છે.તેથી, આ ટેક્નોલોજી સફળતાપૂર્વક વિકસાવવામાં આવી હોવાથી, તે ઘણા વૈજ્ઞાનિક સંશોધકો દ્વારા મૂલ્યવાન છે અને ઘણા ક્ષેત્રોમાં લાગુ કરવામાં આવી છે.

2 સિદ્ધાંતો અને પદ્ધતિઓ

FQ-PCR નો કાર્યકારી સિદ્ધાંત PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ફ્લોરોસન્ટલી લેબલવાળી ચકાસણી ઉમેરવા માટે Taq એન્ઝાઇમની 5′→3′ એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિનો ઉપયોગ કરવાનો છે.પ્રાઈમર સિક્વન્સમાં સમાવિષ્ટ ડીએનએ ટેમ્પલેટ સાથે પ્રોબ ખાસ કરીને હાઇબ્રિડાઇઝ કરી શકે છે.ચકાસણીના 5′છેડાને ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન જનીન FAM (6-કાર્બોક્સિફ્લોરેસીન, 518nm પર ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન પીક) સાથે લેબલ થયેલ છે અને 3′એન્ડને ફ્લોરોસેન્સ ક્વેન્ચિંગ ગ્રુપ TAMRA (6-કાર્બોક્સીટેટ્રામિશન, e28nm પર ફ્લોરોસેન્સ એમિશન પીક), PCR એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન પ્રોબને લંબાવવાથી અટકાવવા માટે ચકાસણીની શરૂઆત ફોસ્ફોરીલેટેડ છે.જ્યારે ચકાસણી અકબંધ રહે છે, ત્યારે ક્વેન્ચર જૂથ ઉત્સર્જક જૂથના ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જનને દબાવી દે છે.એકવાર ઉત્સર્જક જૂથને ક્વેન્ચિંગ ગ્રૂપથી અલગ કરવામાં આવે તે પછી, અવરોધ ઉઠાવી લેવામાં આવે છે, અને 518nm પર ઓપ્ટિકલ ઘનતા વધે છે અને તે ફ્લોરોસેન્સ ડિટેક્શન સિસ્ટમ દ્વારા શોધવામાં આવે છે. પુનઃપ્રાપ્તિ તબક્કામાં, ચકાસણી ટેમ્પલેટ ડીએનએ સાથે સંકર થાય છે, અને એક્સ્ટેંશનના પ્રાઈમ ફેઝમાં ટાક એન્ઝાઇમ એક્સ્ટેંશન સાથે DNA સાથે આગળ વધે છે.જ્યારે ચકાસણી કાપી નાખવામાં આવે છે, ત્યારે ક્વેન્ચિંગ ઇફેક્ટ રિલીઝ થાય છે અને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ રિલીઝ થાય છે.દર વખતે જ્યારે ટેમ્પ્લેટની નકલ કરવામાં આવે છે, ત્યારે ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલના પ્રકાશન સાથે પ્રોબ કાપી નાખવામાં આવે છે.પ્રકાશિત ફ્લોરોફોર્સની સંખ્યા અને પીસીઆર ઉત્પાદનોની સંખ્યા વચ્ચે એક-થી-એક સંબંધ હોવાથી, આ ટેકનિકનો ઉપયોગ નમૂનાને ચોક્કસ રીતે માપવા માટે કરી શકાય છે.પ્રાયોગિક સાધન સામાન્ય રીતે PE કંપની દ્વારા વિકસિત ABI7100 PCR થર્મલ સાયકલનો ઉપયોગ કરે છે અને અન્ય થર્મલ સાયકલનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે.જો પ્રયોગ માટે ABI7700 રિએક્શન ટાઇપ રિએક્શન સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો પ્રતિક્રિયા પૂર્ણ થયા પછી, માત્રાત્મક પરિણામો કમ્પ્યુટર વિશ્લેષણ દ્વારા સીધા જ આપી શકાય છે.જો તમે અન્ય થર્મલ સાયકલર્સનો ઉપયોગ કરો છો, તો તમારે RQ+, RQ-, △RQ ની ગણતરી કરવા માટે તે જ સમયે પ્રતિક્રિયા ટ્યુબમાં ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલને માપવા માટે ફ્લોરોસેન્સ ડિટેક્ટરનો ઉપયોગ કરવાની જરૂર છે.RQ+ એ સેમ્પલ ટ્યુબના ફ્લોરોસન્ટ ઉત્સર્જન જૂથની લ્યુમિનેસેન્સ તીવ્રતા અને ક્વેન્ચિંગ ગ્રૂપની લ્યુમિનેસેન્સ તીવ્રતાના ગુણોત્તરને રજૂ કરે છે, RQ- ખાલી ટ્યુબમાં બેના ગુણોત્તરને રજૂ કરે છે, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) દર્શાવે છે કે પીસીઆર પ્રક્રિયા દરમિયાન ફલૂના સંકેતની માત્રામાં ફેરફાર થઈ શકે છે. .ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સની રજૂઆતને કારણે, પ્રયોગની વિશિષ્ટતા નોંધપાત્ર રીતે સુધારેલ છે.પ્રોબ ડિઝાઇન સામાન્ય રીતે નીચેની શરતોને પૂર્ણ કરતી હોવી જોઈએ: ①બાઈન્ડિંગની વિશિષ્ટતાને સુનિશ્ચિત કરવા માટે ચકાસણીની લંબાઈ લગભગ 20-40 પાયા હોવી જોઈએ.②સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સના ડુપ્લિકેશનને ટાળવા માટે GC પાયાની સામગ્રી 40% અને 60% ની વચ્ચે છે.③ હાઇબ્રિડાઇઝેશન ટાળો અથવા પ્રાઇમર્સ સાથે ઓવરલેપ કરો.④ પ્રોબ અને ટેમ્પ્લેટ વચ્ચેના બાઈન્ડિંગની સ્થિરતા પ્રાઈમર અને ટેમ્પલેટ વચ્ચેની બંધાઈની સ્થિરતા કરતાં વધારે છે, તેથી પ્રોબનું Tm મૂલ્ય પ્રાઈમરના Tm મૂલ્ય કરતાં ઓછામાં ઓછું 5°C વધારે હોવું જોઈએ.વધુમાં, ચકાસણીની સાંદ્રતા, ચકાસણી અને નમૂના ક્રમ વચ્ચેની સમાનતા અને ચકાસણી અને પ્રાઈમર વચ્ચેનું અંતર આ બધાની પ્રાયોગિક પરિણામો પર અસર પડે છે.

સંબંધિત વસ્તુઓ:

ચાઇના Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNase સાથે)(lncRNA માંથી ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ cDNA સંશ્લેષણ માટે સુપર પ્રિમિક્સ) ઉત્પાદક અને સપ્લાયર |ફોરજીન (foreivd.com)

ચાઇના રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર Easyᵀᴹ-Takman ઉત્પાદક અને સપ્લાયર |ફોરજીન (foreivd.com)