qPCR પ્રયોગોમાં, પ્રાઈમર ડિઝાઈન પણ ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ કડી છે.પ્રાઇમર્સ યોગ્ય છે કે નહીં તે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા ધોરણ સુધી પહોંચે છે કે કેમ, એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનો વિશિષ્ટ છે કે કેમ અને પ્રાયોગિક પરિણામો ઉપલબ્ધ છે કે કેમ તેની સાથે નજીકથી સંબંધિત છે.
તો qPCR પ્રાઈમરની વિશિષ્ટતાને વધુ સારી કેવી રીતે બનાવવી?ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા?
આજે, અમે તમને એકસાથે qPCR પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરવા લઈ જઈશું, અને qPCR પ્રાઈમર ડિઝાઇનને પ્રયોગોમાં એક કાર્યક્ષમ જ્ઞાન કૌશલ્ય બનવા દઈશું.
qPCR પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરતી વખતે, સામાન્ય રીતે નીચેના મુદ્દાઓ પર ધ્યાન આપો: પ્રાઇમર્સ શક્ય તેટલા ઇન્ટ્રોન્સમાં ડિઝાઇન કરવા જોઈએ, ઉત્પાદનની લંબાઈ 100-300 bp હોવી જોઈએ, Tm મૂલ્ય શક્ય તેટલું 60°C ની નજીક હોવું જોઈએ, અને અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઇમર્સ શક્ય તેટલા નજીક હોવા જોઈએ, અને પ્રાઈમરનો અંત G અથવા C હોવો જોઈએ, વગેરે રાહ જુઓ.
1. ઇન્ટ્રોન્સમાં ફેલાયેલા પ્રાઇમરની ડિઝાઇન
qPCR પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરતી વખતે, ઇન્ટ્રોન્સમાં ડિઝાઇન કરેલ પ્રાઇમર્સ પસંદ કરવાથી gDNA ટેમ્પલેટને એમ્પ્લીફાય થવાથી રોકી શકાય છે, અને ઉત્પાદનો બધા cDNA ના એમ્પ્લીફિકેશનમાંથી મેળવવામાં આવે છે, આમ gDNA દૂષણના પ્રભાવને દૂર કરે છે.
2. બાળપોથી લંબાઈ
પ્રાઈમર લંબાઈ સામાન્ય રીતે 18-30 nt ની વચ્ચે હોય છે, અને એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટની લંબાઈ શક્ય તેટલી 100-300 bp ની વચ્ચે નિયંત્રિત હોવી જોઈએ.
જો પ્રાઈમર ખૂબ ટૂંકું હોય, તો તે બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જશે, અને જો તે ખૂબ લાંબુ છે, તો તે સરળતાથી ગૌણ માળખું (જેમ કે હેરપિન માળખું) બનાવશે.જો એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદન ખૂબ લાંબુ હોય, તો તે પોલિમરેઝની પ્રતિક્રિયા માટે યોગ્ય નથી, જે પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનની કાર્યક્ષમતાને અસર કરશે.
3. GC સામગ્રી અને Tm મૂલ્ય
પ્રાઇમરની GC સામગ્રી 40% અને 60% ની વચ્ચે નિયંત્રિત હોવી જોઈએ.જો તે ખૂબ ઊંચું અથવા ખૂબ ઓછું હોય, તો તે પ્રતિક્રિયા શરૂ કરવા માટે અનુકૂળ નથી.સમાન Tm મૂલ્ય અને એનિલિંગ તાપમાન મેળવવા માટે આગળ અને વિપરીત પ્રાઇમર્સની GC સામગ્રી સમાન નજીક હોવી જોઈએ.
Tm મૂલ્ય શક્ય હોય ત્યાં સુધી 55-65°C ની વચ્ચે હોવું જોઈએ, સામાન્ય રીતે 60°C ની આસપાસ, અને અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમનું Tm મૂલ્ય શક્ય તેટલું નજીક હોવું જોઈએ, પ્રાધાન્ય 4°C કરતાં વધુ નહીં.
4. પ્રાઈમરના 3′ છેડે A પસંદ કરવાનું ટાળો
જ્યારે પ્રાઈમરનો 3′ છેડો મેળ ખાતો નથી, ત્યારે વિવિધ પાયાની સંશ્લેષણ કાર્યક્ષમતામાં ઘણો તફાવત હોય છે.જ્યારે છેલ્લો આધાર A હોય, ત્યારે તે મેળ ન ખાતા કિસ્સામાં પણ સાંકળ સંશ્લેષણની શરૂઆત કરી શકે છે, અને જ્યારે છેલ્લો આધાર T ક્યારે હોય છે, મિસમેચ ઇન્ડક્શનની કાર્યક્ષમતા ઘણી ઓછી થઈ જાય છે.તેથી, પ્રાઈમરના 3′ છેડે A પસંદ કરવાનું ટાળવાનો પ્રયાસ કરો, અને T પસંદ કરવાનું વધુ સારું છે.
જો તે પ્રોબ પ્રાઈમર હોય, તો ચકાસણીનો 5′ છેડો G ન હોઈ શકે, કારણ કે જ્યારે એક જ G આધાર FAM ફ્લોરોસન્ટ રિપોર્ટર જૂથ સાથે જોડાયેલ હોય, ત્યારે G FAM જૂથ દ્વારા ઉત્સર્જિત ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલને પણ શાંત કરી શકે છે, પરિણામે ખોટા નકારાત્મક પરિણામો આવે છે.દેખાય છે.
5. આધાર વિતરણ
પ્રાઈમરમાં ચાર પાયાનું વિતરણ પ્રાધાન્ય રેન્ડમ છે, 3′ છેડે 3 થી વધુ સળંગ G અથવા C ટાળીને, અને સળંગ 3 થી વધુG અથવા C, GC-સમૃદ્ધ ક્રમ પ્રદેશમાં જોડી બનાવવા માટે સરળ છે.
6. બાળપોથી ડિઝાઇન પ્રદેશ જટિલ ગૌણ માળખાં ટાળવા જોઈએ.
એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટના સિંગલ સ્ટ્રૅન્ડ દ્વારા રચાયેલ ગૌણ માળખું પીસીઆરની સરળ પ્રગતિને અસર કરશે.લક્ષ્ય ક્રમમાં ગૌણ માળખું છે કે કેમ તે અગાઉથી અનુમાન કરીને, પ્રાઇમરની ડિઝાઇનમાં આ પ્રદેશને ટાળવાનો પ્રયાસ કરો.
7. પ્રાઇમર્સ પોતે અને પ્રાઇમર્સ વચ્ચે સતત પૂરક પાયા ટાળવાનો પ્રયાસ કરવો જોઈએ.
પ્રાઈમર અને પ્રાઈમર વચ્ચે કોઈ સળંગ 4 આધાર પૂરક હોઈ શકે નહીં.પ્રાઈમરમાં પોતે પૂરક ક્રમ હોવો જોઈએ નહીં, અન્યથા તે હેરપિન સ્ટ્રક્ચર બનાવવા માટે પોતાને ફોલ્ડ કરશે, જે પ્રાઈમર અને ટેમ્પલેટના એનિલિંગ સંયોજનને અસર કરશે.
અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઇમર્સ વચ્ચે પૂરક સિક્વન્સ અસ્તિત્વમાં નથી.પ્રાઇમર્સ વચ્ચેની પૂરકતા પ્રાઇમર ડાયમર્સનું ઉત્પાદન કરશે, જે PCR કાર્યક્ષમતાને ઘટાડશે અને માત્રાત્મક ચોકસાઈને પણ અસર કરશે.જો પ્રાઈમર-ડાઈમર અને હેરપિન સ્ટ્રક્ચર્સ અનિવાર્ય હોય, તો △G મૂલ્ય ખૂબ ઊંચું ન હોવું જોઈએ (4.5 kcal/mol કરતાં ઓછું હોવું જોઈએ).
8. પ્રાઇમર્સ લક્ષ્ય ચોક્કસ ઉત્પાદનને વિસ્તૃત કરે છે.
qPCR શોધનો અંતિમ ધ્યેય લક્ષ્ય જનીનની વિપુલતાને સમજવાનો છે.જો બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન થાય, તો પરિમાણ અચોક્કસ હશે.તેથી, પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કર્યા પછી, તેમને BLAST દ્વારા પરીક્ષણ કરવાની જરૂર છે, અને ઉત્પાદનોની વિશિષ્ટતા ક્રમ ડેટાબેઝમાં સરખાવવામાં આવે છે.
આગળ, અમે qPCR પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવા માટે માનવ GAS6 (ગ્રોથ અરેસ્ટ સ્પેસિફિક 6) જનીનને ઉદાહરણ તરીકે લઈએ છીએ.
01 ક્વેરી જીન
હોમો GAS6NCBI દ્વારા.અહીં, આપણે જનીન નામ અને પ્રજાતિઓ સુસંગત છે તેની ખાતરી કરવા માટે તેમની સરખામણી કરવા પર ધ્યાન આપવું જોઈએ.
02 જનીન ક્રમ શોધો
(1) જો લક્ષ્ય ક્રમ જીનોમિક ડીએનએ છે, તો પ્રથમ પસંદ કરો, જે જનીનનો જીનોમિક ડીએનએ ક્રમ છે.
(2) જો લક્ષ્ય ક્રમ mRNA હોય, તો બીજો પસંદ કરો.દાખલ કર્યા પછી, નીચેના કોષ્ટકમાં "CDS" પર ક્લિક કરો.બ્રાઉન બેકગ્રાઉન્ડ સિક્વન્સ એ જનીનનો કોડિંગ સિક્વન્સ છે.
03 ડિઝાઇન પ્રાઇમર્સ
પ્રાઈમર-બ્લાસ્ટ ઈન્ટરફેસ દાખલ કરો
ઉપર ડાબી બાજુએ ફાસ્ટા ફોર્મેટમાં જનીન ક્રમ નંબર અથવા ક્રમ દાખલ કરો અને સંબંધિત પરિમાણો ભરો.

"પ્રાઈમર્સ મેળવો" પર ક્લિક કરો અને NCBI તમને જણાવવા માટે પૉપ અપ કરશે કે આવા પેરામીટર પસંદગીને અન્ય સ્પ્લિસિંગ વેરિઅન્ટ્સમાં વિસ્તૃત કરવામાં આવશે.અમે અલગ અલગ સ્પ્લિસિંગ વેરિઅન્ટ્સ તપાસી શકીએ છીએ અને યોગ્ય પ્રાઈમર જોડી મેળવવા માટે તેમને સબમિટ કરી શકીએ છીએ (નીચેની આકૃતિમાં બતાવ્યા પ્રમાણે).આ પ્રક્રિયાને ચાલવામાં દસેક સેકન્ડ લાગી શકે છે.
આ પ્રાઈમર જોડીનું એનિલિંગ તાપમાન લગભગ 60 ° સે છે.પ્રયોગના હેતુ મુજબ, પ્રયોગ માટે મધ્યમ લંબાઈ, સારી વિશિષ્ટતા અને ઓછા સ્વ-પૂરક પ્રાઇમર્સ પસંદ કરો, અને સફળતાનો દર ઘણો ઊંચો છે!
04પ્રાઈમર વિશિષ્ટતા ચકાસણી
વાસ્તવમાં, પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવા ઉપરાંત, પ્રાઇમર-બ્લાસ્ટ અમે જાતે ડિઝાઇન કરેલા પ્રાઇમર્સનું મૂલ્યાંકન પણ કરી શકે છે.પ્રાઈમર ડિઝાઇન પેજ પર પાછા ફરો, અમે ડિઝાઇન કરેલ અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઇમર્સ દાખલ કરો અને અન્ય પેરામીટર એડજસ્ટ કરવામાં આવશે નહીં.સબમિટ કર્યા પછી, તમે જોઈ શકો છો કે પ્રાઇમર્સની જોડી અન્ય જનીનો પર પણ અસ્તિત્વમાં છે કે કેમ.જો તે બધા જનીન પર પ્રદર્શિત થાય છે જેને આપણે એમ્પ્લીફાય કરવા માંગીએ છીએ, જે દર્શાવે છે કે પ્રાઈમરની આ જોડીની વિશિષ્ટતા મહાન છે!(ઉદાહરણ તરીકે, આ પ્રાઈમર ક્વેરીનું એકમાત્ર પરિણામ છે!)

05 પ્રાઇમર ગુણવત્તા ચુકાદો
"સંપૂર્ણ" પ્રાઈમર કેવા પ્રકારનું પ્રાઈમર છે જે "સ્ટાન્ડર્ડ સુધીની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા", "એમ્પ્લીફાઈડ ઉત્પાદન લાક્ષણિકતાઓ" અને "વિશ્વસનીય પ્રાયોગિક પરિણામો" ને જોડે છે?
એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા

ગલન વળાંક
પ્રાઈમર્સની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 90%-110% સુધી પહોંચે છે, જેનો અર્થ એ છે કે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સારી છે, અને ગલન કર્વમાં એક જ ટોચ છે અને સામાન્ય રીતે Tm>80°C છે, જેનો અર્થ છે કે એમ્પ્લીફિકેશનની વિશિષ્ટતા સારી છે.
 
સંબંધિત વસ્તુઓ:
રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર ઇઝી-SYBR ગ્રીન આઇ
રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર ઇઝી-તાકમાન