મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસિસ ટેક્નોલોજી માનવ શરીરની આનુવંશિક સામગ્રી અને વિવિધ પેથોજેન્સની અભિવ્યક્તિ અને માળખું શોધવા માટે મોલેક્યુલર બાયોલોજી પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરે છે, જેથી રોગોની આગાહી અને નિદાનનો હેતુ હાંસલ કરી શકાય.

તાજેતરના વર્ષોમાં, મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક ટેક્નોલોજીના અપગ્રેડિંગ અને પુનરાવૃત્તિ સાથે, મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સની ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન વધુને વધુ વ્યાપક અને ઊંડાણપૂર્વક બની છે, અને મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સ માર્કેટ ઝડપી વિકાસના સમયગાળામાં પ્રવેશ્યું છે.

લેખક બજારમાં સામાન્ય મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક ટેક્નોલોજીનો સારાંશ આપે છે, અને તેને ત્રણ ભાગમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે: પ્રથમ ભાગ PCR ટેક્નોલોજીનો પરિચય આપે છે, બીજા ભાગમાં ન્યુક્લીક એસિડ ઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન ટેક્નોલોજીનો પરિચય આપે છે, અને બીજો ભાગ સિક્વન્સિંગ ટેક્નોલોજીનો પરિચય આપે છે.

01

ભાગ I: પીસીઆર ટેકનોલોજી

પીસીઆર ટેકનોલોજી

પીસીઆર (પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન) એ 30 વર્ષથી વધુનો ઇતિહાસ ધરાવતી ઇન વિટ્રો ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન તકનીકોમાંની એક છે.

પીસીઆર ટેક્નોલોજીની શરૂઆત 1983માં કેરી મુલિસ ઓફ સેટસ, યુએસએ દ્વારા કરવામાં આવી હતી.મુલિસે 1985 માં પીસીઆર પેટન્ટ માટે અરજી કરી અને તે જ વર્ષે વિજ્ઞાન પર પ્રથમ પીસીઆર શૈક્ષણિક પેપર પ્રકાશિત કર્યું.મુલિસે 1993માં રસાયણશાસ્ત્રમાં નોબેલ પુરસ્કાર જીત્યો હતો.

પીસીઆરના મૂળભૂત સિદ્ધાંતો

PCR લક્ષ્ય DNA ટુકડાઓને એક મિલિયન કરતા વધુ વખત વધારી શકે છે.સિદ્ધાંત એ છે કે ડીએનએ પોલિમરેઝના ઉત્પ્રેરક હેઠળ, પિતૃ સ્ટ્રાન્ડ ડીએનએનો નમૂના તરીકે ઉપયોગ થાય છે, અને વિસ્તરણ માટે પ્રારંભિક બિંદુ તરીકે ચોક્કસ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ થાય છે.તે વિટ્રોમાં વિકૃતિકરણ, એનેલીંગ અને એક્સ્ટેંશન જેવા પગલાઓ દ્વારા નકલ કરવામાં આવે છે.પુત્રી સ્ટ્રાન્ડ ડીએનએની પ્રક્રિયા પિતૃ સ્ટ્રાન્ડ ટેમ્પલેટ ડીએનએ માટે પૂરક છે.

માનક પીસીઆર પ્રક્રિયાને ત્રણ તબક્કામાં વહેંચવામાં આવી છે:

1. વિકૃતિકરણ: ડીએનએ ડબલ સ્ટ્રેન્ડને અલગ કરવા માટે ઉચ્ચ તાપમાનનો ઉપયોગ કરો.DNA ડબલ સેર વચ્ચેના હાઇડ્રોજન બોન્ડ ઊંચા તાપમાને (93-98°C) તૂટી જાય છે.

2. એનિલિંગ: ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ અલગ થયા પછી, તાપમાન ઓછું કરવામાં આવે છે જેથી પ્રાઈમર સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ સાથે જોડાઈ શકે.

3. એક્સ્ટેંશન: જ્યારે તાપમાન ઓછું થાય છે ત્યારે ડીએનએ પોલિમરેઝ બંધાયેલ પ્રાઇમર્સમાંથી ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ સાથે પૂરક સેરનું સંશ્લેષણ કરવાનું શરૂ કરે છે.જ્યારે એક્સ્ટેંશન પૂર્ણ થાય છે, ત્યારે એક ચક્ર પૂર્ણ થાય છે, અને ડીએનએ ટુકડાઓની સંખ્યા બમણી થાય છે.

આ ત્રણ પગલાંને 25-35 વખત વળતર આપવાથી, DNA ટુકડાઓની સંખ્યા ઝડપથી વધશે.

પીસીઆરની ચાતુર્ય એ છે કે જુદા જુદા પ્રાઈમર્સને વિવિધ લક્ષ્ય જનીનો માટે ડિઝાઇન કરી શકાય છે, જેથી ટૂંકા ગાળામાં લક્ષ્ય જનીન ટુકડાઓને વિસ્તૃત કરી શકાય.

અત્યાર સુધી, PCR ને ત્રણ શ્રેણીઓમાં વિભાજિત કરી શકાય છે, એટલે કે સામાન્ય PCR, ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR અને ડિજિટલ PCR.

સામાન્ય પીસીઆરની પ્રથમ પેઢી

લક્ષ્ય જનીનને વિસ્તૃત કરવા માટે સામાન્ય પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટનો ઉપયોગ કરો, અને પછી ઉત્પાદનને શોધવા માટે એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ કરો, માત્ર ગુણાત્મક વિશ્લેષણ કરી શકાય છે.

પ્રથમ પેઢીના પીસીઆરના મુખ્ય ગેરફાયદા:

- બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન અને ખોટા હકારાત્મક પરિણામોની સંભાવના.

-તપાસમાં લાંબો સમય લાગે છે અને ઓપરેશન બોજારૂપ છે.

-ફક્ત ગુણાત્મક પરીક્ષણ જ કરી શકાય છે.

બીજી પેઢીના ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક PCR

ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR (રીઅલ-ટાઇમ PCR), જેને qPCR તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તેનો ઉપયોગ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સ ઉમેરીને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલોના સંચય દ્વારા એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનોના સંચયને મોનિટર કરવા માટે થાય છે જે પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમની પ્રગતિને સૂચવી શકે છે, અને ફ્લોરોસેન્સ કર્વ દ્વારા પરિણામોનો નિર્ણય કરવા માટે, અને તે C ની સ્ટાન્ડર્ડ વેલ્યુ અને સ્ટાન્ડર્ડ ક્વોન્ટિફાઇડની મદદ કરી શકે છે.

કારણ કે qPCR ટેક્નોલોજી બંધ સિસ્ટમમાં હાથ ધરવામાં આવે છે, દૂષણની સંભાવના ઓછી થાય છે, અને જથ્થાત્મક તપાસ માટે ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલનું નિરીક્ષણ કરી શકાય છે, તેથી તે ક્લિનિકલ પ્રેક્ટિસમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાય છે અને તે PCRમાં પ્રબળ તકનીક બની ગઈ છે.

રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆરમાં ઉપયોગમાં લેવાતા ફ્લોરોસન્ટ પદાર્થોને આમાં વિભાજિત કરી શકાય છે: ટાકમેન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સ, મોલેક્યુલર બીકોન્સ અને ફ્લોરોસન્ટ ડાયઝ.

1) તકમાન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ:

PCR એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન, પ્રાઈમરની જોડી ઉમેરતી વખતે ચોક્કસ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ ઉમેરવામાં આવે છે.ચકાસણી એ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ છે, અને બે છેડા અનુક્રમે રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને ક્વેન્ચર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ સાથે લેબલ થયેલ છે.

જ્યારે ચકાસણી અકબંધ હોય છે, ત્યારે રિપોર્ટર જૂથ દ્વારા ઉત્સર્જિત ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ શમન જૂથ દ્વારા શોષાય છે;પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન, ટાક એન્ઝાઇમની 5′-3′ એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ તપાસને ફાટી જાય છે અને ડિગ્રેડ કરે છે, જેનાથી રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને ક્વેન્ચર ફ્લોરોસન્ટ જૂથને અલગ કરવામાં આવે છે, જેથી ફ્લોરોસેન્સ મોનિટરિંગ સિસ્ટમ ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ પ્રાપ્ત કરી શકે, એટલે કે, દરેક વખતે એમ્પ્લીફિકેશન અને ડીએનએ ફ્લુઓનું સ્વરૂપ નક્કી કરવામાં આવે છે. ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલનું સંચય સંપૂર્ણપણે પીસીઆર ઉત્પાદનની રચના સાથે સિંક્રનાઇઝ થાય છે.

2) SYBR ફ્લોરોસન્ટ રંગો:

PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં, SYBR ફ્લોરોસન્ટ રંગનો વધુ પડતો ઉમેરો થાય છે.એસવાયબીઆર ફ્લોરોસન્ટ ડાઈને ડીએનએ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડમાં બિન-વિશિષ્ટ રીતે સમાવિષ્ટ કર્યા પછી, તે ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલનું ઉત્સર્જન કરે છે.SYBR ડાય પરમાણુ જે સાંકળમાં સમાવિષ્ટ નથી તે કોઈપણ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલનું ઉત્સર્જન કરશે નહીં, જેનાથી ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલની ખાતરી થાય છે. PCR ઉત્પાદનોમાં વધારો PCR ઉત્પાદનોના વધારા સાથે સંપૂર્ણપણે સુમેળમાં છે.SYBR માત્ર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA સાથે જોડાય છે, તેથી પીસીઆર પ્રતિક્રિયા ચોક્કસ છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે ગલન કર્વનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.

3) મોલેક્યુલર બેકોન્સ

તે સ્ટેમ-લૂપ ડબલ-લેબલવાળી ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રોબ છે જે 5 અને 3 છેડે લગભગ 8 પાયાની હેરપિન માળખું બનાવે છે.બંને છેડે ન્યુક્લીક એસિડ સિક્વન્સ પૂરક રીતે જોડવામાં આવે છે, જેના કારણે ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને ક્વેન્ચિંગ જૂથ ચુસ્ત બને છે.બંધ કરો, તે ફ્લોરોસેન્સ ઉત્પન્ન કરશે નહીં.

પીસીઆર પ્રોડક્ટ જનરેટ થયા પછી, એનેલીંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન, મોલેક્યુલર બીકનનો મધ્ય ભાગ ચોક્કસ ડીએનએ ક્રમ સાથે જોડવામાં આવે છે, અને ફ્લોરોસન્ટ જનીનને ક્વેન્ચર જનીનથી અલગ કરવામાં આવે છે જેથી ફ્લોરોસેન્સ ઉત્પન્ન થાય.

બીજી પેઢીના પીસીઆરના મુખ્ય ગેરફાયદા:

સંવેદનશીલતા હજુ પણ અભાવ છે, અને ઓછી નકલ નમુનાઓની શોધ ચોક્કસ નથી.

પૃષ્ઠભૂમિ મૂલ્ય પ્રભાવ છે, અને પરિણામ દખલગીરી માટે સંવેદનશીલ છે.

ત્રીજી પેઢીના ડિજિટલ પીસીઆર

ડિજિટલ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) અંતિમ-બિંદુ શોધ દ્વારા લક્ષ્ય ક્રમની નકલ નંબરની ગણતરી કરે છે, અને આંતરિક નિયંત્રણો અને પ્રમાણભૂત વળાંકોનો ઉપયોગ કર્યા વિના ચોક્કસ સંપૂર્ણ માત્રાત્મક તપાસ કરી શકે છે.

ડિજિટલ PCR એ એન્ડપોઇન્ટ ડિટેક્શનનો ઉપયોગ કરે છે અને તે Ct મૂલ્ય (સાયકલ થ્રેશોલ્ડ) પર આધાર રાખતું નથી, તેથી ડિજિટલ PCR પ્રતિક્રિયા એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા દ્વારા ઓછી અસર કરે છે, અને PCR પ્રતિક્રિયા અવરોધકોની સહનશીલતા ઉચ્ચ સચોટતા અને પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા સાથે સુધારેલ છે.

ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને ઉચ્ચ સચોટતાની લાક્ષણિકતાઓને લીધે, તે PCR પ્રતિક્રિયા અવરોધકો દ્વારા સરળતાથી દખલ કરી શકતું નથી, અને તે પ્રમાણભૂત ઉત્પાદનો વિના સાચું સંપૂર્ણ પ્રમાણ પ્રાપ્ત કરી શકે છે, જે સંશોધન અને એપ્લિકેશનનું હોટસ્પોટ બની ગયું છે.

પ્રતિક્રિયા એકમના વિવિધ સ્વરૂપો અનુસાર, તેને ત્રણ પ્રકારોમાં વિભાજિત કરી શકાય છે: માઇક્રોફ્લુઇડિક, ચિપ અને ડ્રોપલેટ સિસ્ટમ્સ.