સીટી મૂલ્ય એ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆરનું સૌથી મહત્વપૂર્ણ પરિણામ પ્રસ્તુતિ સ્વરૂપ છે.તેનો ઉપયોગ જનીન અભિવ્યક્તિ તફાવતો અથવા જનીન નકલ નંબરની ગણતરી કરવા માટે થાય છે.તો ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિફિકેશનનું Ct મૂલ્ય શું વાજબી માનવામાં આવે છે?Ct મૂલ્યની અસરકારક શ્રેણી કેવી રીતે સુનિશ્ચિત કરવી?

સીટી મૂલ્ય શું છે?
qPCR એમ્પ્લીફિકેશન પ્રક્રિયા દરમિયાન, એમ્પ્લીફિકેશન સાયકલની અનુરૂપ સંખ્યા (સાયકલ થ્રેશોલ્ડ) જ્યારે એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનનો ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ સેટ ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ સુધી પહોંચે છે.C નો અર્થ સાયકલ અને T નો અર્થ થ્રેશોલ્ડ છે.સરળ શબ્દોમાં કહીએ તો, Ct મૂલ્ય એ qPCR માં જ્યારે પ્રારંભિક ટેમ્પલેટ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનની ચોક્કસ માત્રા સુધી પહોંચે છે ત્યારે તેને અનુરૂપ ચક્રની સંખ્યા છે.કહેવાતા "ઉત્પાદનની ચોક્કસ રકમ" પછીથી વધુ સમજાવવામાં આવશે.

Ct મૂલ્ય શું કરે છે?

1.ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન, ટેમ્પલેટ રકમ અને Ct મૂલ્ય વચ્ચેનો સંબંધ
આદર્શ રીતે, qPCR માં જનીનો ચોક્કસ સંખ્યાના ચક્ર પછી ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા સંચિત થાય છે.એમ્પ્લીફિકેશન ચક્રની સંખ્યા અને ઉત્પાદનોની માત્રા વચ્ચેનો સંબંધ છે: એમ્પ્લીફાઈડ ઉત્પાદન રકમ = પ્રારંભિક નમૂનાની રકમ × (1+En) ચક્ર સંખ્યા.જો કે, qPCR પ્રતિક્રિયા હંમેશા આદર્શ પરિસ્થિતિમાં હોતી નથી.જ્યારે એમ્પ્લીફાઈડ ઉત્પાદનની માત્રા "ચોક્કસ ઉત્પાદન રકમ" સુધી પહોંચે છે, ત્યારે આ સમયે ચક્રની સંખ્યા Ct મૂલ્ય છે, અને તે ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન સમયગાળામાં છે.Ct મૂલ્ય અને પ્રારંભિક નમૂનાની રકમ વચ્ચેનો સંબંધ: નમૂનાના Ct મૂલ્ય અને નમૂનાના પ્રારંભિક નકલ નંબરના લઘુગણક વચ્ચે એક રેખીય સંબંધ છે.પ્રારંભિક ટેમ્પલેટની સાંદ્રતા જેટલી વધારે છે, તેટલું Ct મૂલ્ય ઓછું છે;પ્રારંભિક ટેમ્પલેટની સાંદ્રતા જેટલી ઓછી હશે, Ct મૂલ્ય જેટલું મોટું હશે.

2.એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ, ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ અને ચોક્કસ પીસીઆર ઉત્પાદન રકમ
qPCR એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટનો જથ્થો સીધો જ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલના રૂપમાં રજૂ કરવામાં આવે છે, એટલે કે એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ.પીસીઆરના પ્રારંભિક તબક્કામાં, એમ્પ્લીફિકેશન આદર્શ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ છે, ચક્રની સંખ્યા નાની છે, ઉત્પાદનનું સંચય ઓછું છે, અને ફ્લોરોસેન્સનું સ્તર ફ્લોરોસેન્સ પૃષ્ઠભૂમિથી સ્પષ્ટ રીતે અલગ કરી શકાતું નથી.તે પછી, ફ્લોરોસેન્સ વધે છે અને ઘાતાંકીય તબક્કામાં પ્રવેશ કરે છે.PCR ઉત્પાદનની માત્રા ચોક્કસ બિંદુએ શોધી શકાય છે જ્યારે PCR પ્રતિક્રિયા માત્ર ઘાતાંકીય તબક્કામાં હોય છે, જેનો ઉપયોગ "ઉત્પાદનની ચોક્કસ રકમ" તરીકે થઈ શકે છે, અને નમૂનાની પ્રારંભિક સામગ્રી આમાંથી કાઢી શકાય છે.તેથી, ઉત્પાદનની ચોક્કસ રકમને અનુરૂપ ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલની તીવ્રતા એ ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ છે.

પીસીઆરના અંતિમ તબક્કામાં, એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન બતાવતું નથી, અને રેખીય તબક્કા અને ઉચ્ચપ્રદેશના તબક્કામાં પ્રવેશ કરે છે.

3. Ct મૂલ્યોની પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા
જ્યારે PCR ચક્ર Ct મૂલ્યના ચક્ર નંબર સુધી પહોંચે છે, ત્યારે તે સાચા ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન સમયગાળામાં દાખલ થયો છે.આ સમયે, નાની ભૂલ એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવી નથી, તેથી Ct મૂલ્યની પુનઃઉત્પાદનક્ષમતા ઉત્તમ છે, એટલે કે, એક જ ટેમ્પ્લેટ વિવિધ સમયે અથવા એક જ સમયે વિવિધ ટ્યુબમાં વિસ્તૃત થાય છે.એમ્પ્લીફિકેશન, મેળવેલ Ct મૂલ્ય સ્થિર છે.

1.એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા En
પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા એ કાર્યક્ષમતાનો સંદર્ભ આપે છે જેની સાથે પોલિમરેઝ જનીનને એમ્પ્લીકોનમાં રૂપાંતરિત કરે છે.જ્યારે એક DNA પરમાણુ બે DNA અણુમાં પરિવર્તિત થાય છે ત્યારે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 100% છે.એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને સામાન્ય રીતે En તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે.અનુગામી લેખોના વિશ્લેષણને સરળ બનાવવા માટે, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અસર કરતા પરિબળોને ટૂંકમાં રજૂ કરવામાં આવ્યા છે.

2. Ct મૂલ્યોની શ્રેણી
Ct મૂલ્યો 15-35 સુધીની છે.જો Ct મૂલ્ય 15 કરતા ઓછું હોય, તો એવું માનવામાં આવે છે કે એમ્પ્લીફિકેશન બેઝલાઇન સમયગાળાની શ્રેણીમાં છે અને ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ સુધી પહોંચી નથી.આદર્શ રીતે, Ct મૂલ્ય અને નમૂનાના પ્રારંભિક નકલ નંબરના લઘુગણક વચ્ચે એક રેખીય સંબંધ છે, એટલે કે, પ્રમાણભૂત વળાંક.પ્રમાણભૂત વળાંક દ્વારા, જ્યારે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 100% હોય છે, ત્યારે જનીનની સિંગલ કોપી નંબરને માપવા માટે ગણતરી કરેલ Ct મૂલ્ય લગભગ 35 છે. જો તે 35 કરતા વધારે હોય, તો નમૂનાનો પ્રારંભિક નકલ નંબર સૈદ્ધાંતિક રીતે 1 કરતા ઓછો હોય છે, જે અર્થહીન ગણી શકાય.

વિવિધ જનીન સીટી રેન્જ માટે, પ્રારંભિક નમૂનાની રકમમાં જનીન નકલ નંબર અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતામાં તફાવતને કારણે, જનીન માટે પ્રમાણભૂત વળાંક બનાવવા અને જનીનની રેખીય શોધ શ્રેણીની ગણતરી કરવી જરૂરી છે.

3. Ct મૂલ્યના પરિબળોને પ્રભાવિત કરે છે
એમ્પ્લીફિકેશન ચક્રની સંખ્યા અને ઉત્પાદનની માત્રા વચ્ચેના સંબંધમાંથી: એમ્પ્લીફાઈડ ઉત્પાદનની રકમ = પ્રારંભિક નમૂનાની રકમ × (1+En) ચક્ર સંખ્યા, તે જોઈ શકાય છે કે આદર્શ પરિસ્થિતિઓમાં, પ્રારંભિક નમૂના અને Enની માત્રા Ct મૂલ્ય પર નકારાત્મક અસર કરશે.નમૂનાની ગુણવત્તા અથવા એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતામાં તફાવત Ct મૂલ્યને ખૂબ મોટું અથવા ખૂબ નાનું બનાવશે.

4.Ct મૂલ્ય ખૂબ મોટું અથવા ખૂબ નાનું છે