રિયલ ટાઈમ પીસીઆર, જેને માત્રાત્મક PCR અથવા qPCR તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તે PCR એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોના વાસ્તવિક-સમયની દેખરેખ અને વિશ્લેષણ માટેની પદ્ધતિ છે.
કારણ કે જથ્થાત્મક પીસીઆરમાં સરળ કામગીરી, ઝડપી અને અનુકૂળ, ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા, સારી પુનરાવર્તિતતા અને નીચા દૂષણ દરના ફાયદા છે, તેનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ તબીબી પરીક્ષણ, દવાની અસરકારકતા આકારણી, જનીન અભિવ્યક્તિ સંશોધન, ટ્રાન્સજેનિક સંશોધન, જનીન શોધ, રોગકારક શોધ, પ્રાણી અને છોડની તપાસમાં થાય છે., ખોરાક પરીક્ષણ અને અન્ય ક્ષેત્રો.
તેથી, ભલે તમે જીવન વિજ્ઞાનના મૂળભૂત સંશોધનમાં રોકાયેલા હોવ, અથવા ફાર્માસ્યુટિકલ કંપનીઓ, પશુપાલન કંપનીઓ, ખાદ્ય કંપનીઓના કર્મચારીઓ અથવા તો એન્ટ્રી-એક્ઝિટ ઇન્સ્પેક્શન અને ક્વોરેન્ટાઇન બ્યુરો, પર્યાવરણીય દેખરેખ વિભાગ, હોસ્પિટલો અને અન્ય એકમોના કર્મચારીઓ, તમે વધુ કે ઓછા સંપર્કમાં હશો અથવા તમારે PCR ક્વોન્ટિટીનું જ્ઞાન જાણવાની જરૂર છે.

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆરનો સિદ્ધાંત

રીયલ ટાઈમ પીસીઆર એ એક એવી પદ્ધતિ છે જેમાં પીસીઆર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ફ્લોરોસન્ટ પદાર્થો ઉમેરવામાં આવે છે, અને પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની પ્રક્રિયામાં ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલની તીવ્રતાનું વાસ્તવિક સમયમાં જથ્થાત્મક પીસીઆર સાધન દ્વારા નિરીક્ષણ કરવામાં આવે છે, અને અંતે પ્રાયોગિક ડેટાનું વિશ્લેષણ અને પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે.

【એમ્પ્લીફિકેશન વળાંક】PCR ની ગતિશીલ પ્રક્રિયાનું વર્ણન કરતો વળાંક છે.પીસીઆરનું એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ વાસ્તવમાં પ્રમાણભૂત ઘાતાંકીય વળાંક નથી, પરંતુ સિગ્મોઇડ વળાંક છે.

[એમ્પ્લીફિકેશન કર્વનો પ્લેટફોર્મ તબક્કો]પીસીઆર ચક્રની સંખ્યામાં વધારો, ડીએનએ પોલિમરેઝની નિષ્ક્રિયતા, ડીએનટીપી અને પ્રાઇમર્સની અવક્ષય અને બાય-પ્રોડક્ટ પાયરોફોસ્ફેટ વગેરે દ્વારા સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયાના અવરોધ વગેરે સાથે, પીસીઆર હંમેશા ઝડપથી વિસ્તરણ કરતું નથી., અને છેવટે એક ઉચ્ચપ્રદેશમાં પ્રવેશ કરશે.

[એમ્પ્લીફિકેશન કર્વનો ઘાતાંકીય વૃદ્ધિ ક્ષેત્ર]જોકે ઉચ્ચપ્રદેશનો તબક્કો ઘણો બદલાય છે, એમ્પ્લીફિકેશન કર્વના ઘાતાંકીય વૃદ્ધિ ક્ષેત્રના ચોક્કસ ક્ષેત્રમાં, પુનરાવર્તિતતા ખૂબ સારી છે, જે પીસીઆરના જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ માટે ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.

[થ્રેશોલ્ડ મૂલ્ય અને સીટી મૂલ્ય]અમે એમ્પ્લીફિકેશન કર્વના ઘાતાંકીય વૃદ્ધિ ક્ષેત્રમાં યોગ્ય સ્થાન પર ફ્લોરોસેન્સ ડિટેક્શનની મર્યાદા મૂલ્ય સેટ કરીએ છીએ, એટલે કે થ્રેશોલ્ડ મૂલ્ય (થ્રેશોલ્ડ).થ્રેશોલ્ડ મૂલ્ય અને એમ્પ્લીફિકેશન કર્વનું આંતરછેદ એ Ct મૂલ્ય છે, એટલે કે, જ્યારે થ્રેશોલ્ડ મૂલ્ય સુધી પહોંચી જાય ત્યારે Ct મૂલ્ય ચક્રની સંખ્યા (થ્રેશોલ્ડ ચક્ર) નો સંદર્ભ આપે છે.

નીચેનો ગ્રાફ થ્રેશોલ્ડ લાઇન અને એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ, થ્રેશોલ્ડ અને Ct મૂલ્ય વચ્ચેનો સંબંધ સ્પષ્ટપણે દર્શાવે છે.

【કેવી રીતે પરિમાણ કરવું?】

તે ગાણિતિક સિદ્ધાંત દ્વારા સાબિત થયું છે કે Ct મૂલ્ય પ્રારંભિક નમૂનાઓની સંખ્યાના લઘુગણક સાથે વ્યસ્ત રેખીય સંબંધ ધરાવે છે.રિયલ ટાઈમ પીસીઆર પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટ્સનું રીઅલ ટાઈમમાં મોનિટર કરે છે અને ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન તબક્કા દરમિયાન તેનું પ્રમાણ નક્કી કરે છે.

પીસીઆરના દરેક ચક્ર માટે, ડીએનએ 2 ગણો ઝડપથી વધ્યો, અને ટૂંક સમયમાં ઉચ્ચ સ્તર પર પહોંચી ગયો.

ધારી રહ્યા છીએ કે પ્રારંભિક DNA નું પ્રમાણ A છે₀ , n ચક્ર પછી, ડીએનએ ઉત્પાદનની સૈદ્ધાંતિક રકમ આ રીતે વ્યક્ત કરી શકાય છે:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

પછી, પ્રારંભિક DNA રકમ A 0 જેટલી વધુ છે, એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનની રકમ જેટલી વહેલી તકે શોધ મૂલ્ય An સુધી પહોંચે છે, અને જ્યારે An સુધી પહોંચે છે ત્યારે ચક્રની સંખ્યા Ct મૂલ્ય છે.એટલે કે, પ્રારંભિક DNA રકમ A 0 જેટલી વધુ છે, એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ શિખરો વહેલામાં આવે છે, અને તેને અનુરૂપ ચક્ર n ની જરૂરી સંખ્યા ઓછી હોય છે.

અમે જાણીતી સાંદ્રતાના ધોરણનું ગ્રેડિએન્ટ ડિલ્યુશન હાથ ધરીએ છીએ અને તેનો રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર માટે નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરીએ છીએ અને ડીએનએની રકમ વધુથી ઓછી શરૂ કરવાના ક્રમમાં સમાન અંતરાલો પર એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ્સની શ્રેણી મેળવવામાં આવશે.Ct મૂલ્ય અને પ્રારંભિક નમૂનાઓની સંખ્યાના લઘુગણક વચ્ચેના રેખીય સંબંધ અનુસાર, a[માનક વળાંક] બનાવી શકાય છે.

પ્રમાણભૂત વળાંકમાં અજ્ઞાત એકાગ્રતા સાથે નમૂનાના Ct મૂલ્યને બદલીને, અજ્ઞાત એકાગ્રતા સાથે નમૂનાની પ્રારંભિક ટેમ્પલેટ રકમ મેળવી શકાય છે, જે રીઅલ ટાઇમ પીસીઆરનો માત્રાત્મક સિદ્ધાંત છે.

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆરની તપાસ પદ્ધતિ

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ફ્લોરોસેન્સની તીવ્રતા શોધીને પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોને શોધે છે.

ફ્લોરોસન્ટ ડાય એમ્બેડિંગ પદ્ધતિનો સિદ્ધાંત】

ફ્લોરોસન્ટ રંગો, જેમ કે ટીબી ગ્રીન ® , પીસીઆર સિસ્ટમમાં ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ સાથે બિન-વિશિષ્ટ રીતે જોડાઈ શકે છે અને બંધન પર ફ્લોરોસેસ કરી શકે છે.

પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ફ્લોરોસેન્સની તીવ્રતા પીસીઆર ચક્રના વધારા સાથે ઝડપથી વધી છે.ફ્લોરોસેન્સની તીવ્રતા શોધીને, પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશનની માત્રાને વાસ્તવિક સમયમાં મોનિટર કરી શકાય છે, અને પછી નમૂનામાં પ્રારંભિક નમૂનાની માત્રાનો ઉલટા અંદાજ કરી શકાય છે.

【ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ પદ્ધતિનો સિદ્ધાંત】

ફ્લોરોસન્ટ ચકાસણી5′ છેડે ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને 3′ છેડે શમન જૂથ સાથેનો ન્યુક્લિક એસિડ ક્રમ છે, જે ખાસ કરીને નમૂના સાથે જોડાઈ શકે છે.જ્યારે ચકાસણી અકબંધ હોય છે, ત્યારે ફ્લોરોફોર દ્વારા ઉત્સર્જિત ફ્લોરોસેન્સને ક્વેન્ચિંગ જૂથ દ્વારા શાંત કરવામાં આવે છે અને તે ફ્લોરોસેસ કરી શકતું નથી.જ્યારે ચકાસણીનું વિઘટન થાય છે, ત્યારે ફ્લોરોસન્ટ પદાર્થ અલગ થઈ જશે અને ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન કરશે.

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા સોલ્યુશનમાં ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ ઉમેરવામાં આવે છે.એનેલીંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન, ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ ટેમ્પલેટની ચોક્કસ સ્થિતિ સાથે જોડાશે.એક્સ્ટેંશન પ્રક્રિયા દરમિયાન, પીસીઆર એન્ઝાઇમની 5′→3′ એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ નમૂના સાથે હાઇબ્રિડાઇઝ્ડ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબને વિઘટિત કરી શકે છે, અને ફ્લોરોસન્ટ પદાર્થને ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન કરવા માટે અલગ કરવામાં આવે છે.પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં તપાસની ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતાને શોધીને, પીસીઆર ઉત્પાદનની એમ્પ્લીફિકેશન રકમનું નિરીક્ષણ કરવાનો હેતુ પ્રાપ્ત કરી શકાય છે.

【ફ્લોરોસેન્સ શોધ પદ્ધતિની પસંદગી】

જો તેનો ઉપયોગ ઉચ્ચ હોમોલોજી સાથેના સિક્વન્સને અલગ પાડવા અને મલ્ટિપ્લેક્સ પીસીઆર ડિટેક્શન જેમ કે SNP ટાઇપિંગ વિશ્લેષણ કરવા માટે કરવામાં આવે છે, તો ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ પદ્ધતિ બદલી ન શકાય તેવી છે.
અન્ય રીયલ ટાઈમ પીસીઆર પ્રયોગો માટે, એક સરળ, સરળ અને ઓછી કિંમતની ફ્લોરોસન્ટ કાઈમેરા પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.

તપાસ મજબૂત વિશિષ્ટતા, મલ્ટિપ્લેક્સ પીસીઆર માટે સક્ષમ

ખામી

એમ્પ્લીફિકેશન માટે ઉચ્ચ વિશિષ્ટતા આવશ્યકતાઓ;

મલ્ટિપ્લેક્સ પીસીઆર કરી શકાતું નથી ચોક્કસ પ્રોબ ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે, ઊંચી કિંમત;

કેટલીકવાર પ્રોબ ડિઝાઇન મુશ્કેલ હોય છે

સંબંધિત વસ્તુઓ: