પીસીઆર એ સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી ન્યુક્લીક એસિડ એમ્પ્લીફિકેશન ટેકનોલોજી છે અને તેની સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતાને કારણે તેનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.જો કે, પીસીઆરને વારંવાર થર્મલ ડિનેચરેશનની જરૂર પડે છે અને તે સાધનો અને સાધનો પર આધાર રાખવાની મર્યાદાઓથી છૂટકારો મેળવી શકતો નથી, જે ક્લિનિકલ ફિલ્ડ ટેસ્ટિંગમાં તેનો ઉપયોગ મર્યાદિત કરે છે.
1990 ના દાયકાની શરૂઆતથી, ઘણી પ્રયોગશાળાઓએ સતત તાપમાન એમ્પ્લીફિકેશન ટેકનોલોજી વિકસાવવાનું શરૂ કર્યું છે જેને થર્મલ ડિનેચરેશનની જરૂર નથી.હવે તેઓએ લૂપ-મીડિયેટેડ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન ટેક્નોલોજી, સ્ટ્રાન્ડ રિપ્લેસમેન્ટ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન ટેક્નોલોજી, રોલિંગ સર્કલ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન ટેક્નોલોજી અને ન્યુક્લીક એસિડ સિક્વન્સ ડિપેન્ડન્સ વિકસાવી છે.આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન ટેકનોલોજી અને અન્ય ટેકનોલોજી.
Loop-મધ્યસ્થી ઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન
એમ્પ્લીફિકેશન સિદ્ધાંત એ હકીકત પર આધારિત છે કે DNA લગભગ 65°C પર ગતિશીલ સંતુલન સ્થિતિમાં છે.જ્યારે કોઈપણ પ્રાઈમર બેઝ-પેયર થાય છે અને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએના પૂરક ભાગ સુધી વિસ્તરે છે, ત્યારે અન્ય સ્ટ્રાન્ડ અલગ થઈ જશે અને સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડ થઈ જશે.
આ તાપમાને, ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડ-ડિસ્પ્લેસમેન્ટ ડીએનએ પોલિમરેઝ પર આધાર રાખવા માટે 4 ચોક્કસ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરે છે જેથી સ્ટ્રેન્ડ-ડિસ્પ્લેસમેન્ટ ડીએનએનું સંશ્લેષણ સતત થઈ શકે.
પ્રથમ લક્ષ્ય જનીન પર 6 ચોક્કસ પ્રદેશો F3, F2, F1, B1, B2, B3 નક્કી કરો અને પછી આ 6 વિશિષ્ટ પ્રદેશોના આધારે 4 પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરો (નીચેની આકૃતિમાં બતાવ્યા પ્રમાણે):
ફોરવર્ડ ઇનર પ્રાઇમર (FIP) F1c અને F2 થી બનેલું છે.
બેકવર્ડ ઇનર પ્રાઇમર (BIP) B1c અને B2 થી બનેલું છે, અને TTTT મધ્યમાં સ્પેસર તરીકે વપરાય છે.
બાહ્ય પ્રાઇમર્સ F3 અને B3 અનુક્રમે લક્ષ્ય જનીન પર F3 અને B3 પ્રદેશોથી બનેલા છે.
LAMP પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં, આંતરિક પ્રાઈમરની સાંદ્રતા બાહ્ય પ્રાઈમર કરતા ઘણી ગણી છે.ડીએનએ ડબલ સ્ટ્રૅન્ડ બનાવવા માટે પૂરક સ્ટ્રૅન્ડનું સંશ્લેષણ કરવા માટે આંતરિક પ્રાઈમરને સૌપ્રથમ ટેમ્પલેટ સ્ટ્રૅન્ડ સાથે જોડવામાં આવે છે.ત્યારબાદ, ડીએનએ ડબલ સ્ટ્રેન્ડ બનાવવા માટે બાહ્ય પ્રાઈમરને ટેમ્પલેટ સ્ટ્રેન્ડ સાથે જોડવામાં આવે છે.BstDNA પોલિમરેઝની ક્રિયા હેઠળ, આંતરિક પ્રાઈમર દ્વારા સંશ્લેષિત પૂરક સ્ટ્રાન્ડ બહાર પાડવામાં આવે છે.શ્રેણીબદ્ધ પ્રતિક્રિયાઓ પછી, પૂરક સ્ટ્રેન્ડ અંતે ડમ્બેલ સ્ટ્રક્ચર સાથે એક જ DNA સ્ટ્રાન્ડ બનાવે છે.
ડમ્બબેલ સ્ટ્રક્ચર ડીએનએ સિંગલ સ્ટ્રાન્ડનો ઉપયોગ ખુલ્લા છેડા સાથે સતત ટ્રાન્ઝિશનલ સ્ટેમ-લૂપ સ્ટ્રક્ચર ડીએનએ બનાવવા માટે ટેમ્પલેટ તરીકે થાય છે.આંતરિક અને બાહ્ય પ્રાઇમર્સ ટ્રાન્ઝિશનલ સ્ટેમ-લૂપ સ્ટ્રક્ચર ડીએનએને સતત સ્ટ્રાન્ડ ડિસ્પ્લેસમેન્ટ અને એક્સટેન્શન રિએક્શન્સમાંથી પસાર થવા માટે માર્ગદર્શન આપે છે અને અંતે વિવિધ લંબાઈ સાથે બહુવિધ સ્ટેમ-લૂપ સ્ટ્રક્ચર્સ બનાવે છે.ડીએનએ મિશ્રણ.
લૂપ-મીડિયેટેડ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશનના ફાયદા અને ગેરફાયદા
LAMP ના ફાયદા:
(1) ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા, જે 1 કલાકની અંદર લક્ષ્ય જનીનની 1-10 નકલોને અસરકારક રીતે વિસ્તૃત કરી શકે છે અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સામાન્ય PCR કરતા 10-100 ગણી છે.
(2) પ્રતિક્રિયા સમય ટૂંકો છે, વિશિષ્ટતા મજબૂત છે, અને કોઈ ખાસ સાધનોની જરૂર નથી.
LAMP ની ખામીઓ:
(1) પ્રાઇમર્સ માટેની આવશ્યકતાઓ ખાસ કરીને ઊંચી છે.
(2) એમ્પ્લીફાઈડ પ્રોડક્ટનો ઉપયોગ ક્લોનિંગ અને સિક્વન્સિંગ માટે કરી શકાતો નથી, પરંતુ તેનો ઉપયોગ માત્ર નિર્ણય માટે થઈ શકે છે.
(3) તેની મજબૂત સંવેદનશીલતાને લીધે, એરોસોલ બનાવવું સરળ છે, જે ખોટા હકારાત્મકનું કારણ બને છે અને પરીક્ષણ પરિણામોને અસર કરે છે.
Sટ્રૅન્ડ ડિસ્પ્લેસમેન્ટ એમ્પ્લીફિકેશન
સ્ટ્રેન્ડ ડિસ્પ્લેસમેન્ટ એમ્પ્લીફિકેશન (એસડીએ) એ 1992 માં અમેરિકન વિદ્વાન વોકર દ્વારા પ્રસ્તાવિત એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયા પર આધારિત એક ઇન વિટ્રો આઇસોથર્મલ ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન તકનીક છે.
SDA ની મૂળભૂત સિસ્ટમમાં પ્રતિબંધ એન્ડોન્યુક્લીઝ, સ્ટ્રાન્ડ ડિસ્પ્લેસમેન્ટ પ્રવૃત્તિ સાથે DNA પોલિમરેઝ, બે જોડી પ્રાઇમર્સ, dNTPs અને કેલ્શિયમ અને મેગ્નેશિયમ આયનો અને બફર સિસ્ટમનો સમાવેશ થાય છે.
સ્ટ્રાન્ડ ડિસ્પ્લેસમેન્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનો સિદ્ધાંત લક્ષ્ય ડીએનએના બંને છેડે રાસાયણિક રીતે સંશોધિત પ્રતિબંધ એન્ડોન્યુક્લીઝ ઓળખ ક્રમ પર આધારિત છે.એન્ડોન્યુક્લીઝ સ્ટ્રાન્ડ ડીએનએમાં તેની ઓળખની જગ્યા પર ગેપ ખોલે છે, અને ડીએનએ પોલિમરેઝ ગેપ 3′ એન્ડને વિસ્તરે છે અને આગામી ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડને બદલે છે.
ડીએનએના બદલાયેલા સિંગલ સ્ટ્રેન્ડને પ્રાઇમર્સ સાથે જોડી શકાય છે અને ડીએનએ પોલિમરેઝ દ્વારા ડબલ સેરમાં વિસ્તૃત કરી શકાય છે.આ પ્રક્રિયા સતત પુનરાવર્તિત થાય છે, જેથી લક્ષ્ય ક્રમ અસરકારક રીતે વિસ્તૃત થાય.
સ્ટ્રાન્ડ ડિસ્પ્લેસમેન્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ટેકનોલોજીના ફાયદા અને ગેરફાયદા
SDA ના ફાયદા:
એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા ઊંચી છે, પ્રતિક્રિયા સમય ટૂંકો છે, વિશિષ્ટતા મજબૂત છે, અને કોઈ ખાસ સાધનોની જરૂર નથી.
SDA ની ખામીઓ:
ઉત્પાદનો એકસમાન હોતા નથી, અને કેટલાક સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ અને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ઉત્પાદનો હંમેશા એસડીએ ચક્રમાં ઉત્પન્ન થાય છે, અને જ્યારે ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવે ત્યારે ટેલિંગ અનિવાર્યપણે થાય છે.
Rolling વર્તુળ એમ્પ્લીફિકેશન
રોલિંગ સર્કલ એમ્પ્લીફિકેશન (RCA) રોલિંગ સર્કલ દ્વારા પેથોજેનિક સજીવોમાંથી ડીએનએની નકલ કરવાની પદ્ધતિ પર રેખાંકન દ્વારા પ્રસ્તાવિત છે.તે લક્ષ્ય જનીનનું એમ્પ્લીફિકેશન હાંસલ કરવા માટે રોલિંગ સર્કલ ડીએનએ સંશ્લેષણની ક્રિયા હેઠળ સ્થિર તાપમાને એક ટેમ્પલેટ તરીકે સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ગોળાકાર ડીએનએનો ઉપયોગ અને ખાસ ડીએનએ પોલિમરેઝ (જેમ કે Phi29) નો ઉલ્લેખ કરે છે.
RCA ને રેખીય એમ્પ્લીફિકેશન અને ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશનમાં વિભાજિત કરી શકાય છે.રેખીય RCA ની કાર્યક્ષમતા 10 સુધી પહોંચી શકે છે5વખત, અને ઘાતાંકીય RCA ની કાર્યક્ષમતા 10 સુધી પહોંચી શકે છે9વખત
સરળ ભેદ, નીચેની આકૃતિમાં બતાવ્યા પ્રમાણે, રેખીય એમ્પ્લીફિકેશન a માત્ર 1 પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરે છે, ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશન b 2 પ્રાઈમર ધરાવે છે.
લીનિયર આરસીએને સિંગલ પ્રાઈમર આરસીએ પણ કહેવામાં આવે છે.પ્રાઈમર ગોળાકાર ડીએનએ સાથે જોડાય છે અને ડીએનએ પોલિમરેઝની ક્રિયા દ્વારા વિસ્તૃત થાય છે.ઉત્પાદન એ એક રેખીય સિંગલ સ્ટ્રૅન્ડ છે જેમાં મોટી સંખ્યામાં પુનરાવર્તિત સિક્વન્સ એક જ લૂપની લંબાઈ કરતા હજારો ગણા છે.
લીનિયર આરસીએનું ઉત્પાદન હંમેશા પ્રારંભિક પ્રાઈમર સાથે જોડાયેલ હોવાથી, સિગ્નલનું સરળ ફિક્સેશન એ એક મોટો ફાયદો છે.
ઘાતાંકીય RCA, જેને હાયપર બ્રાન્ચ્ડ એમ્પ્લીફિકેશન HRCA (હાયપર બ્રાન્ચ્ડ RCA) તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, ઘાતાંકીય RCA માં, એક પ્રાઈમર RCA ઉત્પાદનને વિસ્તૃત કરે છે, બીજું પ્રાઈમર RCA ઉત્પાદન સાથે સંકર કરે છે અને વિસ્તરે છે, અને રિપ્લેસમેન્ટ પહેલાથી જ RCA ઉત્પાદન સાથે બંધાયેલ છે ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઈમર્સ સ્ટ્રૅન્ડને વિસ્તૃત કરે છે, અને RCA ઉત્પાદનને પુનરાવર્તિત કરવા માટે પુનરાવર્તિત થાય છે.
રોલિંગ સર્કલ ન્યુક્લીક એસિડ એમ્પ્લીફિકેશનના ફાયદા અને ગેરફાયદા
RCA ના ફાયદા:
ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા, સારી વિશિષ્ટતા અને સરળ કામગીરી.
આરસીએની ખામીઓ:
સિગ્નલ શોધ દરમિયાન પૃષ્ઠભૂમિ સમસ્યાઓ.આરસીએ પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, અનસર્ક્યુલેટેડ પેડલોક પ્રોબ અને અનબાઉન્ડ પ્રોબના ટેમ્પલેટ ડીએનએ અથવા આરએનએ કેટલાક પૃષ્ઠભૂમિ સંકેતો પેદા કરી શકે છે.
Nucleicacid ક્રમ-આધારિત એમ્પ્લીફિકેશન
ન્યુક્લીક એસિડ સિક્વન્સ-આધારિત એમ્પ્લીફિકેશન (NASBA) એ PCR ના આધારે વિકસિત નવી ટેકનોલોજી છે.તે T7 પ્રમોટર સિક્વન્સ સાથે પ્રાઇમરની જોડી દ્વારા સંચાલિત સતત અને આઇસોથર્મલ ન્યુક્લિક એસિડ એમ્પ્લીફિકેશન છે.ટેક્નોલોજી લગભગ 2 કલાકમાં ટેમ્પલેટ RNA ને લગભગ 109 ગણી વધારી શકે છે, જે પરંપરાગત PCR પદ્ધતિ કરતાં 1000 ગણી વધારે છે અને તેને ખાસ સાધનોની જરૂર નથી.
આ ટેક્નોલોજીનો ઉપયોગ રોગોના ઝડપી નિદાન માટે થાય છે કે તે દેખાય છે અને હાલમાં ઘણી કંપનીઓ આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ આરએનએ ડિટેક્શન કિટમાં કરે છે.
જોકે આરએનએ એમ્પ્લીફિકેશન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પીસીઆર ટેક્નોલોજીનો પણ ઉપયોગ કરી શકે છે, એનએએસબીએના પોતાના ફાયદા છે: તે પ્રમાણમાં સ્થિર તાપમાનની સ્થિતિમાં કરી શકાય છે, અને તે પરંપરાગત પીસીઆર તકનીક કરતાં વધુ સ્થિર અને સચોટ છે.
પ્રતિક્રિયા 41 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર છે અને તેને પૂર્ણ કરવા માટે AMV (એવિયન માયલોબ્લાસ્ટોસિસ વાયરસ) રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, RNase H, T7 RNA પોલિમરેઝ અને પ્રાઈમર્સની જોડીની જરૂર છે.
પ્રક્રિયામાં મુખ્યત્વે શામેલ છે:
ફોરવર્ડ પ્રાઈમર T7 પ્રમોટરનો પૂરક ક્રમ ધરાવે છે.પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, ફોરવર્ડ પ્રાઈમર આરએનએ સ્ટ્રાન્ડ સાથે જોડાય છે અને ડીએનએ-આરએનએ ડબલ સ્ટ્રાન્ડ બનાવવા માટે એએમવી એન્ઝાઇમ દ્વારા ઉત્પ્રેરિત થાય છે.
RNase H RNA ને હાઇબ્રિડ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડમાં ડાયજેસ્ટ કરે છે અને સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડ DNA જાળવી રાખે છે.
રિવર્સ પ્રાઈમર અને AMV એન્ઝાઇમની ક્રિયા હેઠળ, T7 પ્રમોટર સિક્વન્સ ધરાવતી DNA ડબલ સ્ટ્રાન્ડ રચાય છે.
T7 RNA પોલિમરેઝની ક્રિયા હેઠળ, ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રક્રિયા પૂર્ણ થાય છે અને મોટી માત્રામાં લક્ષ્ય RNA ઉત્પન્ન થાય છે.
નાસ્બાના ફાયદા:
(1) તેના પ્રાઈમરમાં T7 પ્રમોટર સિક્વન્સ છે, પરંતુ વિદેશી ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNAમાં T7 પ્રમોટર સિક્વન્સ નથી અને તેને વિસ્તૃત કરી શકાતું નથી, તેથી આ ટેક્નોલોજી ઉચ્ચ વિશિષ્ટતા અને સંવેદનશીલતા ધરાવે છે.
(2) એનએએસબીએ એમ્પ્લીફિકેશન રિએક્શનમાં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રક્રિયાને સીધી રીતે સામેલ કરે છે, પ્રતિક્રિયાના સમયને ટૂંકાવે છે.
નાસ્બાના ગેરફાયદા:
(1) પ્રતિક્રિયા ઘટકો વધુ જટિલ છે.
(2) પ્રતિક્રિયા ખર્ચ વધુ કરવા માટે ત્રણ પ્રકારના ઉત્સેચકોની જરૂર પડે છે.
પોસ્ટ સમય: ઓગસ્ટ-06-2021
