RT-qPCR એ મોલેક્યુલર બાયોલોજીનો મૂળભૂત પ્રયોગ છે, અને દરેક વ્યક્તિ તેનાથી પરિચિત હોવા જોઈએ.તેમાં મુખ્યત્વે ત્રણ પગલાં શામેલ છે: આરએનએ નિષ્કર્ષણ, સીડીએનએમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર.તે મદદ કરતું નથી, શું થઈ રહ્યું છે?સંભવ છે કે ત્યાં કોઈ સમસ્યા છેરિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રયોગ!જોકે એવું લાગે છે કે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રયોગમાં ફક્ત RNA, dNTP, પ્રાઈમર્સ અને ઉમેરવાની જરૂર છેરિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં અને સારી રીતે ભળી દો, પરંતુ વાસ્તવિક કામગીરીની પ્રક્રિયામાં, હજુ પણ ઘણી વિગતો છે જેના પર ધ્યાન આપવાની જરૂર છે.ચાલો તેના વિશે જાણીએ!

આરએનએની ગુણવત્તા કેવી રીતે નક્કી કરવી?
સીડીએનએ મેળવવા માટે, આરએનએની ગુણવત્તા મહત્વપૂર્ણ છે!આરએનએ ગુણવત્તા મુખ્યત્વે બે પાસાઓથી શોધી શકાય છે:
(1) આરએનએ અખંડિતતા:આરએનએ અખંડિતતા એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા ચકાસી શકાય છે. યુકેરીયોટ્સને ઉદાહરણ તરીકે લેતા, સંપૂર્ણ કુલ આરએનએ ત્રણ સ્પષ્ટ બેન્ડ ધરાવે છે, મોટાથી નાના સુધીના પરમાણુ વજન 28S, 18S અને 5S છે, અને 28S 18S કરતા બમણું તેજસ્વી છે;જો ત્રણ બેન્ડ જોઈ શકાય છે, પરંતુ બેન્ડનો પ્રકાર અસ્પષ્ટ છે અથવા ડિફ્યુઝનનો અર્થ છે કે આરએનએ આંશિક રીતે ડિગ્રેડેડ છે.આ સમયે, કૃપા કરીને તરત જ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શન કરો અને ટેમ્પલેટ ઇનપુટને યોગ્ય રીતે વધારો;જો માત્ર નાના પરમાણુ વજનવાળા બેન્ડ અથવા કોઈ બેન્ડ જોવા ન મળે, તો આરએનએ સંપૂર્ણપણે ડિગ્રેજ થઈ ગયું છે અને તેને ફરીથી કાઢવાની જરૂર છે.એજિલેન્ટ 2100 પીક ડાયાગ્રામ અને RIN મૂલ્ય સાથે RNA ની અખંડિતતા દર્શાવે છે.જો ન્યુક્લિક એસિડ અકબંધ હોય, તો ઇલેક્ટ્રોફેરોગ્રામની આધારરેખા સપાટ હોય છે;જો ન્યુક્લિક એસિડ ગંભીર રીતે અધોગતિ પામે છે, તો આધારરેખા અસમાન છે અને વધુ અધોગતિ શિખરો દેખાય છે;RIN નું મૂલ્ય RNA ની અખંડિતતાને પ્રતિબિંબિત કરે છે, 0-10 ની રેન્જમાં, મૂલ્ય જેટલું મોટું, RNA ની ગુણવત્તા વધુ સારી.સારું, પૂર્ણતાની ડિગ્રી જેટલી વધારે છે.
(2) આરએનએની શુદ્ધતા:OD260/280 નો ગુણોત્તર યુવી સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રી દ્વારા શોધી શકાય છે.જો OD260/280 નો ગુણોત્તર 1.9 અને 2.1 ની વચ્ચે હોય, તો શુદ્ધતા ખૂબ સારી છે.
શેષ જીનોમિક ડીએનએ અચોક્કસ જથ્થાત્મક પરિણામો તરફ દોરી શકે છે
જ્યારે આરએનએ કાઢવામાં આવે છે, ત્યારે આપણને જે આરએનએ મળે છે તે જીનોમિક ડીએનએ (જીડીએનએ) સાથે મિશ્રિત થઈ શકે છે જે સાફ કરવામાં આવ્યું નથી.તેથી, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પછીના cDNA પણ સાથે મિશ્ર કરવામાં આવશેજીડીએનએ.ડાઉનસ્ટ્રીમ દરમિયાનqPCRપ્રતિક્રિયા,સીડીએનએઅને gDNA એકસાથે એમ્પ્લીફાય થઈ શકે છે, જે પ્રમાણમાં નાનું સીટી મૂલ્યમાં પરિણમે છે, તેથી પરિણામો પક્ષપાતી હોઈ શકે છે.
તો આ પરિસ્થિતિમાં આપણે શું કરવું જોઈએ?ફોરજીનસૂચવે છે:
(1) વિપરીત આરએનએ પર જીનોમ સફાઈ કરો, જે આરએનએ નિષ્કર્ષણ દરમિયાન કૉલમ નિષ્કર્ષણ દ્વારા દૂર કરી શકાય છે;
(2) DNase સાથે કાઢવામાં આવેલ આરએનએની સારવાર કરોI , પરંતુ તેને EDTA સાથે સમાપ્ત કરો;
રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રીએજન્ટ્સનુંજીનોમ ક્લિયરિંગ મોડ્યુલો સાથે;

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે પ્રાઈમર કેવી રીતે પસંદ કરવું?
રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રાઈમર્સ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શનના પરિણામને પણ અસર કરે છે.પ્રયોગના ચોક્કસ સંજોગો અનુસાર રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે તમે રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ, ઓલિગો ડીટી અથવા જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ પસંદ કરી શકો છો:
(1) ચોક્કસ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ: જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સની ભલામણ કરવામાં આવે છે;
(2) લાંબા ટુકડો ટ્રાન્સક્રિપ્ટઓલિગો ડીટી/જીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમરની ભલામણ કરવામાં આવે છે;
(3) લાંબા-સેગમેન્ટ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સના આંતરિક ટુકડાઓ: જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ/રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ/રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ + ઓલિગો ડીટી.જો અનુગામી qPCR પ્રયોગ કરવામાં આવે તો, Oligo dT નો એકલા ઉપયોગ કરી શકાતો નથી, કારણ કે એકલા Oligo dT નો ઉપયોગ કરવાથી 3′ અંતનો પૂર્વગ્રહ થઈ શકે છે, જે અચોક્કસ qPCR પ્રયોગના પરિણામો તરફ દોરી જાય છે;
(4) miRNA: સ્ટેમ-લૂપ પ્રાઇમર્સ અથવા ટેલિંગ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.

ક્વોન્ટિફિકેશન માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રોડક્ટ cDNA ને કેટલી વાર પાતળું કરવું જોઈએ?
રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રોડક્ટનું cDNA મેળવ્યા પછી, qPCR પ્રયોગો માટે cDNA ને કેટલી વાર પાતળું કરવું જોઈએ તે ખૂબ મહત્વનું છે.જો સીડીએનએ સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી અથવા ખૂબ ઓછી હોય, તો એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અસર થઈ શકે છે.શું cDNA સાંદ્રતા માપી શકાય છે અને તે કેવી રીતે કરવું જોઈએ?
(1) રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રોડક્ટની cDNA સાંદ્રતા માપી શકાતી નથી, કારણ કે cDNA પ્રોડક્ટ ઉપરાંત, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રોડક્ટમાં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન રેસિડ્યુઅલ બફર, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, પ્રાઈમર્સ વગેરેનો પણ સમાવેશ થાય છે, જે એકાગ્રતા માપનના પરિણામોમાં દખલ કરશે અને તેથી OD260/280, OD260/280 અને abDNA260, OD260/280 અને abdn236 નું સાચું પ્રતિબિંબ પાડતું નથી. ક્ષેત્રઆ સમયે, કેટલાક મિત્રો કહેશે, પછી હું શુદ્ધિકરણ પછી એકાગ્રતા માપીશ;અહીં, ફોરજીન એ યાદ અપાવવા માંગે છે કે સીડીએનએને શુદ્ધ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવતી નથી, કારણ કે રિવર્સલ દ્વારા મેળવેલા સીડીએનએની લંબાઈ અલગ છે, અને શુદ્ધિકરણમાં ટૂંકા સીડીએનએ ખોવાઈ જશે.
(2) તો શું કરવું?qPCR પ્રયોગ પહેલાં, સીડીએનએનું મંદન ઢાળ પૂર્વ-પ્રયોગ દ્વારા નક્કી કરી શકાય છે.ઉદાહરણ તરીકે: qPCR પ્રયોગો માટે નમૂનાઓ તરીકે cDNA સ્ટોક સોલ્યુશન, 10-ગણો મંદન અને 100-ગણો મંદનનો ઉપયોગ કરો અને 18-28 ની રેન્જમાં CT મૂલ્ય સાથે મંદન પરિબળ પસંદ કરો.

miRNA ને કેવી રીતે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવું જોઈએ?
miRNA એ લગભગ 22 nt નું કદ ધરાવતું સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડ નાના અણુ RNA છે જે પ્રોટીન માટે કોડ કરતું નથી.તેની ટૂંકી લંબાઈને કારણે, પરંપરાગત qPCR પદ્ધતિથી તેનું સીધું પ્રમાણ નક્કી કરવું મુશ્કેલ છે, તેથી ઘણી વખત miRNA ને વિસ્તારવું જરૂરી છે;miRNA માટે સામાન્ય રીતે વપરાતી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પદ્ધતિઓમાં સ્ટેમ-લૂપ પદ્ધતિ અને ટેઇલિંગ પદ્ધતિનો સમાવેશ થાય છે.
સ્ટેમ-લૂપ પદ્ધતિ સ્ટેમ-લૂપ પ્રાઇમર્સ ઉમેરીને miRNA ને વિસ્તારવાની છે.આ શોધ પદ્ધતિમાં ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા છે, પરંતુ તપાસ થ્રુપુટ ઓછી છે.એક રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માત્ર એક miRNA અને આંતરિક સંદર્ભ શોધી શકે છે;પૂંછડી ઉમેરવાની પદ્ધતિ બે બનેલી છે તે બે ઉત્સેચકોની સંયુક્ત ક્રિયા દ્વારા પૂર્ણ થાય છે, જે પોલીએ પોલિમરેઝ અને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ છે.PolyA પોલિમરેઝ તેની લંબાઈ વધારવા માટે miRNA માં PolyA પૂંછડીઓ ઉમેરવા માટે જવાબદાર છે, અને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયા કરે છે.આ પદ્ધતિમાં ઉચ્ચ શોધ થ્રુપુટ છે અને તે એક રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનમાં બહુવિધ miRNAs અને આંતરિક સંદર્ભોને શોધી શકે છે, પરંતુ સ્ટેમ-લૂપ પદ્ધતિમાં સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા ઓછી છે.