પીસીઆર, બહુવિધ પીસીઆર, સ્થિતિમાં પી.સી.આર, રિવર્સ પીસીઆર, RT-PCR, qPCR (1)-પીસીઆર

અમે વિવિધ પીસીઆરની વિભાવનાઓ, પગલાં અને વિગતોને છટણી કરીશું

Ⅰ. પીસીઆર

પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન, જેને પીસીઆર તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, તે એક મોલેક્યુલર જૈવિક તકનીક છે જેનો ઉપયોગ ચોક્કસ ડીએનએ ટુકડાઓને વિસ્તૃત કરવા માટે થાય છે.તેને વિટ્રોમાં ખાસ ડીએનએ પ્રતિકૃતિ તરીકે ગણી શકાય.ડીએનએ પોલિમરેઝ (ડીએનએ પોલિમરેઝ I) 1955 ની શરૂઆતમાં મળી આવ્યું હતું, અને ઇ. કોલીનો ક્લેનો ટુકડો, જે પ્રાયોગિક મૂલ્ય અને વ્યવહારિકતા ધરાવે છે, તે 1970ના દાયકાના પ્રારંભમાં ડૉ. એચ. ક્લેનોવ દ્વારા શોધવામાં આવ્યું હતું, પરંતુ કારણ કે આ એન્ઝાઇમ તાપમાનને સહન કરતું નથી, તેથી ઉચ્ચ તાપમાન તેને ડીજનરેટ કરી શકે છે, તેથી તે ઉચ્ચ તાપમાન પોલિમરેઝની પ્રતિક્રિયાને પૂર્ણ કરતું નથી.આજે ઉપયોગમાં લેવાતા ઉત્સેચકો (જેને Taq પોલિમરેઝ કહેવાય છે), 1976માં ગરમ ​​પાણીના પાણીના બેક્ટેરિયમ થર્મસ એક્વેટીકસથી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા. તેની લાક્ષણિકતા એ છે કે તે ઊંચા તાપમાનનો પ્રતિકાર કરી શકે છે અને તે એક આદર્શ એન્ઝાઇમ છે, પરંતુ 1980 પછી તેનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.પીસીઆરના મૂળ આદિમ પ્રોટોટાઇપનો મૂળ ખ્યાલ જનીન સમારકામ અને નકલ સમાન છે, જે 1971માં ડૉ. કેજેલ ક્લેપે દ્વારા પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવ્યો હતો. તેમણે પ્રથમ સરળ અને ટૂંકા ગાળાની જનીન નકલ (PCRની પ્રથમ બે ચક્ર પ્રતિક્રિયાઓ જેવી જ) પ્રકાશિત કરી હતી.આજે વિકસિત થયેલ પીસીઆર 1983માં ડૉ. કેરી બી. મુલિસે વિકસાવ્યું હતું. ડૉ. મુલિસે તે વર્ષે પીઈ કંપનીઓને સેવા આપી હતી, તેથી પીસીઆર ઉદ્યોગમાં પીઈનો વિશેષ દરજ્જો છે.ડૉ. મુલિસે 1985માં સાઈકી અને અન્ય લોકો સાથે પ્રથમ સંબંધિત પેપર સત્તાવાર રીતે પ્રકાશિત કર્યું હતું. ત્યારથી, પીસીઆરનો ઉપયોગ દરરોજ હજારો માઈલ છે, અને સંબંધિત કાગળોની ગુણવત્તા અન્ય ઘણી સંશોધન પદ્ધતિઓને અપ્રિય બનાવે છે તેમ કહી શકાય.ત્યારબાદ, પીસીઆર ટેકનોલોજીનો જૈવિક વૈજ્ઞાનિક સંશોધન અને ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન્સમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે, જે મોલેક્યુલર બાયોલોજી સંશોધનની સૌથી મહત્વપૂર્ણ તકનીક બની છે.મુલિસે 1993માં રસાયણશાસ્ત્રમાં નોબેલ પુરસ્કાર પણ જીત્યો હતો.

પીસીઆરસિદ્ધાંત

પીસીઆર ટેક્નોલોજીનો મૂળભૂત સિદ્ધાંત ડીએનએની કુદરતી પ્રતિકૃતિ પ્રક્રિયા જેવો જ છે અને તેની વિશિષ્ટતા ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઈડ પ્રાઈમર પર આધારિત છે જે લક્ષ્ય ક્રમના બંને છેડાને પૂરક છે.પીસીઆર ડિજનરેશન-એનિલિંગ-વિસ્તરણ ત્રણ મૂળભૂત પ્રતિક્રિયાઓના પગલાંથી બનેલું છે: ① ટેમ્પલેટ ડીએનએનું અધોગતિ: ટેમ્પલેટ ડીએનએ ચોક્કસ સમયગાળા માટે લગભગ 93 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર ગરમ થાય પછી, પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા બનેલા ડ્યુઅલ-ચેન ડીએનએ માટે ડ્યુઅલ ડીએનએ સોલ્યુશન, ટેમ્પલેટ સાથે તેને એક મુખ્ય ડીએનએ બનાવવા માટે તૈયાર કરી શકાય છે જેથી તે એક ચેઇનિંગ ડીએનએ સાથે મળી શકે. આગામી રાઉન્ડની પ્રતિક્રિયા.② ટેમ્પલેટ ડીએનએ અને પ્રાઈમરનું એનિલિંગ (કમ્પાઉન્ડ): ટેમ્પલેટ ડીએનએ ગરમ થઈ જાય અને એક જ સાંકળમાં ડિજનરેટ થઈ જાય પછી, તાપમાન લગભગ 55 ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી ઘટી જાય છે.પ્રાઈમર અને ટેમ્પલેટ ડીએનએ સિંગલ-ચેઈનનો પૂરક ક્રમ.③પ્રાઈમરનું વિસ્તરણ: DNA ટેમ્પલેટ-પ્રાઈમર બાઈન્ડિંગ TaqDNA પોલિમરેઝની ક્રિયા પર આધારિત છે, જેમાં પ્રતિક્રિયા કાચી સામગ્રી તરીકે dNTP છે.પ્રતિકૃતિનો સિદ્ધાંત રાખો, ટેમ્પલેટ DNA સાંકળને પૂરક બનાવતી નવી અર્ધ-અનામત કૉપિ ચેઇનનું સંશ્લેષણ કરો અને ચક્ર અધોગતિ-એનિલિંગ-એક્સ્ટેંશન ત્રણ પ્રક્રિયાઓનું પુનરાવર્તન કરો વધુ "અર્ધ-આરક્ષિત કૉપિ ચેઇન" મેળવી શકે છે, અને આ નવી સાંકળ ફરીથી ઉપલબ્ધ છે આગામી ચક્ર માટે નમૂના બનો.લૂપને પૂર્ણ કરવામાં 2-4 મિનિટ લાગે છે, લક્ષ્ય જનીનને 2-3 કલાકમાં ઘણી મિલિયન વખત વિસ્તૃત કરી શકાય છે.

ધોરણપીસીઆરપ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ

પીસીઆર પ્રતિક્રિયાના પાંચ ઘટકો

PCR પ્રતિક્રિયામાં મુખ્યત્વે પાંચ પ્રકારના પદાર્થો સામેલ છે, જેમ કે પ્રાઈમર, એન્ઝાઇમ, dNTP, ટેમ્પલેટ અને બફર (Mg2+ જરૂરી છે).[PCR પ્રક્રિયા]

માનક પીસીઆર પ્રક્રિયાને ત્રણ તબક્કામાં વહેંચવામાં આવી છે

1. ડીએનએ ડિજનરેશન (90°C-96°C): થર્મલ એક્શન હેઠળ ડ્યુઅલ-ચેઇન ડીએનએ ટેમ્પ્લેટ્સ, હાઇડ્રોજન બોન્ડ તૂટી જાય છે, સિંગલ-ચેઇન DNA બનાવે છે.

2. એનીલિંગ (25℃ -65℃): સિસ્ટમનું તાપમાન ઘટે છે, પ્રાઈમરને DNA ટેમ્પલેટ સાથે જોડવામાં આવે છે જેથી સ્થાનિક ડ્યુઅલ-ચેઈન બને.

3. એક્સ્ટેંશન (70℃ -75℃): Taq એન્ઝાઇમની ક્રિયા હેઠળ (લગભગ 72°C, શ્રેષ્ઠ પ્રવૃત્તિ), dNTP નો ઉપયોગ કાચા માલ તરીકે થાય છે, પ્રાઈમરના 5′ છેડાથી 3′ છેડા સુધી વિસ્તરે છે, સંશ્લેષણ અને ટેમ્પલેટ એકબીજાની DNA સાંકળના પૂરક છે.

દરેક ચક્ર ડીએનએ સામગ્રીને બમણું કરીને, વિકૃત, અનીલ અને વિસ્તૃત છે.હાલમાં, ટૂંકા એમ્પ્લીફિકેશન વિસ્તારને કારણે, Taq એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ શ્રેષ્ઠ ન હોય તો પણ, કેટલાક PCR ખૂબ જ ટૂંકા સમયમાં નકલ કરી શકાય છે, તેથી તેને બે પગલામાં બદલી શકાય છે, એટલે કે, એનિલિંગ અને એક્સ્ટેંશન એક જ સમયે 60°C-65°C પર કરી શકાય છે.પ્રશિક્ષણ અને ઠંડકની પ્રક્રિયાને ઘટાડવા અને પ્રતિભાવ ગતિમાં સુધારો કરવા માટે.

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા લક્ષણો

● ઉચ્ચ-વિશિષ્ટતા

PCR પ્રતિભાવના ચોક્કસ નિર્ણાયક પરિબળો છે: ① પ્રાઈમર અને ટેમ્પલેટ ડીએનએનું ચોક્કસ સંયોજન.②બેઝ પેરિંગનો સિદ્ધાંત.③ TaqDNA પોલિમરેઝ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયાની વફાદારી.④ લક્ષ્ય જનીનની વિશિષ્ટતા અને રૂઢિચુસ્તતા.

પ્રાઇમર્સ અને ટેમ્પલેટ્સનું યોગ્ય સંયોજન એ ચાવી છે.પ્રાઈમર અને ટેમ્પલેટનું બંધન અને પ્રાઈમર ચેઈનનું વિસ્તરણ આલ્કલાઇન બેઝ મેચિંગના સિદ્ધાંત પર આધારિત છે.પોલિમરેઝ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયાઓની વફાદારી અને પ્રતિક્રિયામાં ટેમ્પલેટ અને પ્રાઈમરને બંધનકર્તા (સંયોજક) બનાવવા માટે Taq DNA પોલિમરેઝનું ઉચ્ચ તાપમાન પ્રતિકાર ઉચ્ચ તાપમાને કરી શકાય છે.સંયોજનની વિશિષ્ટતા મોટા પ્રમાણમાં વધી છે.ક્લિપ ઉચ્ચ સ્તરની શુદ્ધતા જાળવી શકે છે.ઉચ્ચ રૂઢિચુસ્તતા અને ઉચ્ચ રૂઢિચુસ્તતા સાથે લક્ષ્ય આનુવંશિક પ્રદેશ પસંદ કરીને, તેની વિશિષ્ટતા વધારે છે.

● ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા

પીસીઆર ઉત્પાદનોના ઉત્પાદનની માત્રા અનુક્રમણિકા દ્વારા વધે છે, જે માઇક્રોકન્ટ્રોલરના સ્તરને માઇક્રોગ્રામ (μg= -6) ના સ્તર સુધી વધારવા માટે પીકર (PG=10-12) ના પ્રારંભિક નમૂનાને વિસ્તૃત કરી શકે છે.1 મિલિયન કોષોમાંથી લક્ષ્ય કોષો શોધી શકાય છે;વાયરસની શોધમાં, પીસીઆરની સંવેદનશીલતા 3 આરએફયુ સુધી પહોંચી શકે છે (ખાલી જગ્યાઓથી બનેલા એકમો);બેક્ટેરિયલ વિજ્ઞાનમાં ન્યૂનતમ શોધ દર 3 બેક્ટેરિયા છે.

● સરળ અને ઝડપી

PCR પ્રતિબિંબ ઉચ્ચ-તાપમાન Taq DNA પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે, જે એક સમયે પ્રતિક્રિયા સોલ્યુશન ઉમેરે છે, એટલે કે, DNA એમ્પ્લીફિકેશન સોલ્યુશન અને વોટર બાથ પોટ પર ડીજનરેશન-એનિલ-એક્સ્ટેંશન પ્રતિક્રિયા.સામાન્ય રીતે, એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયા 2 થી 4 કલાકમાં પૂર્ણ થાય છે.સંવર્ધિત ઉત્પાદનોનું સામાન્ય રીતે વિદ્યુત તલવાર દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે, અને તેમાં આઇસોટોપ્સનો ઉપયોગ કરવાની જરૂર નથી, કોઈ કિરણોત્સર્ગી પ્રદૂષણ નથી અને સરળ પ્રમોશન.

● નમૂનાની શુદ્ધતા ઓછી છે

વાયરસ અથવા બેક્ટેરિયા અને કલ્ચર સેલ્સને અલગ કરવાની જરૂર નથી.ડીએનએ ક્રૂડ ઉત્પાદનો અને આરએનએ એમ્પ્લીફાયર તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે.DNA એમ્પ્લીફિકેશન ડિટેક્શનનો સીધો ઉપયોગ ક્લિનિકલ નમુનાઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે જેમ કે લોહી, શરીરનું પ્રવાહી, ઉધરસ ધોવાનું પ્રવાહી, વાળ, કોષો અને જીવંત પેશીઓ.

પીસીઆરસામાન્ય સમસ્યાઓ

● ખોટા નકારાત્મક, કોઈ એમ્પ્લીફાઈડ બેન્ડ નથી

પીસીઆર પ્રતિક્રિયાના મુખ્ય તબક્કાઓમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છે: ① નમૂના ન્યુક્લિક એસિડની તૈયારી, ② ગુણવત્તા અને પ્રાઇમરની વિશિષ્ટતા, ③ ઉત્સેચકોની ગુણવત્તા ④ પીસીઆર ચક્ર પરિસ્થિતિઓ.કારણ શોધવા માટે ઉપરોક્ત લિંક્સ માટે પણ વિશ્લેષણ અને અભ્યાસ કરવો જોઈએ.

નમૂનાઓ: ① નમૂનામાં પરચુરણ પ્રોટીન હોય છે, ② નમૂનામાં Taq એન્ઝાઇમ અવરોધક હોય છે, ③ નમૂનામાં પ્રોટીન નાબૂદ થતું નથી, ખાસ કરીને રંગસૂત્રમાં જૂથ પ્રોટીન.⑤ ડિમિનર ન્યુક્લીક એસિડ ડિજનરેશન સંપૂર્ણ નથી.જ્યારે ઉત્સેચકો અને પ્રાઈમર્સની ગુણવત્તા સારી હોય છે, ત્યારે કોઈ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ હોતું નથી, જે મોટે ભાગે નમૂનાઓની પાચન સારવાર છે.ટેમ્પલેટ ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયામાં કંઈક ખોટું છે, તેથી અસરકારક અને સ્થિર પાચન ઉકેલ તૈયાર કરવા માટે, તેની પ્રક્રિયા નિશ્ચિત હોવી જોઈએ અને મનસ્વી રીતે બદલવી જોઈએ નહીં.

એન્ઝાઇમ નિષ્ક્રિયકરણ: એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ ખોવાઈ ગઈ છે અથવા અપૂરતી છે કે કેમ તે વિશ્લેષણ કરવા માટે નવા એન્ઝાઇમ અથવા જૂના અને નવા બંને ઉત્સેચકોનો એકસાથે ઉપયોગ કરવો જોઈએ, જે ખોટા નકારાત્મક તરફ દોરી જાય છે.એ નોંધવું જોઈએ કે Taq એન્ઝાઇમ અથવા એથિડિયમ બ્રોમાઇડ ક્યારેક ભૂલી જાય છે.

પ્રાઈમર: પ્રાઈમરની ગુણવત્તા, પ્રાઈમરની સાંદ્રતા અને બે પ્રાઈમરની સાંદ્રતા સપ્રમાણ છે કે કેમ.પીસીઆર નિષ્ફળતા અથવા વધતી જતી બેન્ડ આદર્શ નથી અને ફેલાવવાની સંભાવના છે તે એક સામાન્ય કારણ છે.કેટલાક બેચ નંબરના પ્રાઇમરની ગુણવત્તામાં સમસ્યા છે.બે પ્રાઇમર્સમાં ઊંચી સાંદ્રતા અને ઓછી સાંદ્રતા હોય છે, જેના કારણે ઓછી કાર્યક્ષમતા અસમપ્રમાણ એમ્પ્લીફિકેશન થાય છે.કાઉન્ટરમેઝર્સ છે: ① એકમોને સંશ્લેષણ કરવા માટે સારી પ્રાઈમર પસંદ કરો.② પ્રાઈમરની સાંદ્રતા માત્ર OD મૂલ્ય પર આધારિત નથી, પરંતુ અગર સુગર જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ બનાવવા માટે પ્રાઈમરના મૂળ પ્રવાહી પર પણ ધ્યાન આપે છે.પ્રાઈમર સ્ટ્રીપ ઝોન હોવો જોઈએ અને બે પ્રાઈમરની તેજ સામાન્ય રીતે સુસંગત હોવી જોઈએ.બેલ્ટ, પીસીઆર આ સમયે નિષ્ફળ થઈ શકે છે, અને તેને પ્રાઈમર સિન્થેસિસ યુનિટ સાથે ઉકેલવું જોઈએ.જો પ્રાઈમર વધારે હોય, તો તેજ ઓછી હોય છે, અને જ્યારે પાતળું કરવામાં આવે ત્યારે તેની સાંદ્રતા સંતુલિત હોવી જોઈએ.③ રેફ્રિજરેટરના બહુવિધ ફ્રીઝિંગ અથવા લાંબા ગાળાના રેફ્રિજરેશન ભાગોને રોકવા માટે પ્રાઈમરને ચૂકવણી કરવી જોઈએ અને ઊંચી સાંદ્રતામાં સંગ્રહિત કરવી જોઈએ, જેનાથી પ્રાઈમર બગડે છે અને બગડે છે.④ પ્રાઈમરની ડિઝાઈન ગેરવાજબી છે, જેમ કે પ્રાઈમરની લંબાઈ અપૂરતી છે અને પ્રાઈમર વચ્ચે ડી ક્લસ્ટર બને છે.

Mg2+ સાંદ્રતા: Mg2+ આયન સાંદ્રતા PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પર મોટી અસર કરે છે.અતિશય એકાગ્રતા પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનના વિજાતીયતાને ઘટાડી શકે છે.જો સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન આઉટપુટ વિસ્તરણ બેન્ડ વિના પણ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન નિષ્ફળ બનાવશે.

પ્રતિક્રિયાના જથ્થામાં ફેરફાર: PCR એમ્પ્લીફિકેશનમાં વપરાતું વોલ્યુમ 20ul, 30ul, અને 50ul અથવા 100uL છે, PCR એમ્પ્લીફિકેશન માટેની એપ્લિકેશનનો મોટો જથ્થો વૈજ્ઞાનિક સંશોધન અને ક્લિનિકલ પરીક્ષણના વિવિધ હેતુઓ અનુસાર સેટ કરવામાં આવ્યો છે.નાના વોલ્યુમો જેમ કે 20ul બનાવ્યા પછી, કદ બનાવતી વખતે કોર્ડ શરત બનાવવી જરૂરી છે, અન્યથા તે નિષ્ફળ જશે.

ભૌતિક કારણો: PCR એમ્પ્લીફિકેશન માટે રૂપાંતર ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.જો અધોગતિનું તાપમાન ઓછું હોય, તો અધોગતિનો સમય ઓછો હોય, તે ખોટા નકારાત્મકમાં થવાની સંભાવના છે;ખૂબ ઓછું એનિલિંગ તાપમાન બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનું કારણ બની શકે છે અને ચોક્કસ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા ઘટાડી શકે છે.PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને ઘટાડવા માટે પ્રાઇમર્સ અને ટેમ્પલેટ્સના સંયોજનને ખૂબ અસર કરે છે.કેટલીકવાર એક્સ્ટેંશન અથવા પાણીમાં દ્રાવ્ય કૂકરમાં પરિવર્તનશીલતા, એનેલીંગ અને વિસ્તૃત તાપમાન શોધવા માટે પ્રમાણભૂત થર્મોમીટર્સનો ઉપયોગ કરવો જરૂરી છે, જે પીસીઆરની નિષ્ફળતા માટેનું એક કારણ છે.

ટાર્ગેટ સિક્વન્સ વેરિઅન્ટ્સ: જો લક્ષ્ય ક્રમ થાય છે, પરિવર્તન અથવા કાઢી નાખવામાં આવે છે, પ્રોટોટાઇપ અને ટેમ્પ્લેટનું સંયોજન જોડવામાં આવે છે, અથવા લક્ષ્ય ક્રમના અભાવને કારણે, પ્રાઈમર અને ટેમ્પ્લેટ પૂરક ક્રમ ગુમાવશે, અને તેનું PCR એમ્પ્લીફિકેશન સફળ થશે નહીં.

● ખોટા હકારાત્મક

PCR એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ લક્ષ્ય ક્રમ બેન્ડ સાથે સુસંગત દેખાય છે, અને કેટલીકવાર તેનો બેન્ડ વધુ સુઘડ અને ઉચ્ચ હોય છે.

પ્રાઈમર ડિઝાઇન યોગ્ય નથી: પસંદ કરેલ એમ્પ્લીફિકેશન સિક્વન્સ અને નોન-પર્પઝ એમ્પ્લીફિકેશન સિક્વન્સ હોમોલોગસ હોય છે, તેથી જ્યારે PCR એમ્પ્લીફિકેશન, એમ્પ્લીફાઈડ PCR પ્રોડક્ટ્સ બિન-હેતુપૂર્ણ ક્રમ હોય છે.લક્ષ્ય ક્રમ ખૂબ ટૂંકો છે અથવા પ્રાઈમર ખૂબ ટૂંકો છે, અને તે ખોટા હકારાત્મક માટે ભરેલું છે.ફરીથી ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે.

લક્ષ્ય ક્રમ અથવા એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોનું ક્રોસ પ્રદૂષણ: આ પ્રદૂષણના બે કારણો છે: પ્રથમ, સમગ્ર જીનોમ અથવા મોટા ભાગોનું ક્રોસ-પોલ્યુશન, જે ખોટા હકારાત્મક તરફ દોરી જાય છે.આ પ્રકારના ખોટા હકારાત્મકને નીચેની પદ્ધતિઓ દ્વારા ઉકેલી શકાય છે: સેમ્પલ બંદૂકમાં શ્વાસમાં લેવાથી અથવા સેન્ટ્રીફ્યુગલ ટ્યુબમાંથી સ્પ્લેશ થવાથી લક્ષ્ય ક્રમને રોકવા માટે ઓપરેશન દરમિયાન સાવચેત અને નમ્રતા રાખો.ઉત્સેચકો અને પદાર્થો સિવાય કે જે ઊંચા તાપમાનનો સામનો કરી શકતા નથી, બધા રીએજન્ટ્સ અથવા સાધનોને ઉચ્ચ દબાણથી જંતુમુક્ત કરવું જોઈએ.કેન્દ્રત્યાગી પાઈપો અને નમૂનાઓનો ઉપયોગ એક સમયે થવો જોઈએ.જ્યારે જરૂરી હોય ત્યારે, નમૂનાઓ ઉમેરતા પહેલા, પ્રતિક્રિયા ટ્યુબ અને રીએજન્ટ હાલના ન્યુક્લિક એસિડનો નાશ કરવા માટે અલ્ટ્રાવાયોલેટ કિરણોના સંપર્કમાં આવે છે.બીજું, હવાના પ્રદૂષણમાં નાના ટુકડાઓ.આ નાના ટુકડાઓ લક્ષ્ય ક્રમ કરતા ટૂંકા હોય છે, પરંતુ તેમની પાસે ચોક્કસ હોમોલોજી છે.તે એકબીજા સાથે વિભાજિત કરી શકાય છે.પ્રાઇમર્સને પૂરક બનાવ્યા પછી, પીસીઆર ઉત્પાદનને વિસ્તૃત કરી શકાય છે, જે ખોટા હકારાત્મક ઉત્પાદનનું કારણ બનશે.તેનો ઉપયોગ નેસ્ટ પીસીઆર પદ્ધતિને ઘટાડવા અથવા દૂર કરવા માટે થઈ શકે છે.

● બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ દેખાય છે

પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પછી દેખાતા બેન્ડ્સ અપેક્ષિત કદ સાથે અસંગત છે, અથવા મોટા અથવા નાના, અથવા તે જ સમયે, અથવા તે જ સમયે, ચોક્કસ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ્સ અને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન બેન્ડ્સ.બિન-વિશિષ્ટ બેન્ડ્સનો ઉદભવ છે: પ્રથમ, પ્રાઇમર્સ લક્ષ્ય ક્રમ માટે અપૂર્ણ પૂરક છે, અથવા ડી ક્લસ્ટર બનાવવા માટે પ્રાઇમરનું પોલિમરાઇઝેશન છે.બીજું એ છે કે MG2+આયનોની સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી છે, એનીલિંગ તાપમાન ખૂબ ઓછું છે, અને PCR ચક્રની સંખ્યા સંબંધિત છે.બીજું, ઉત્સેચકોની ગુણવત્તા અને માત્રા.ઘણીવાર, કેટલાક સ્ત્રોતોના ઉત્સેચકો બિન-વિશિષ્ટ બેન્ડ માટે સંવેદનશીલ હોય છે અને અન્ય સ્ત્રોતના ઉત્સેચકો ઉત્પન્ન થતા નથી.કેટલીકવાર ઉત્સેચકોનું બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન પણ થાય છે.પ્રતિકારક પગલાં છે: જો જરૂરી હોય તો આકર્ષકને ફરીથી ડિઝાઇન કરો.એન્ઝાઇમની માત્રામાં ઘટાડો કરો અથવા અન્ય સ્ત્રોતના એન્ઝાઇમને બદલો.પ્રાથમિકની માત્રામાં ઘટાડો કરો, યોગ્ય રીતે નમૂનાઓની માત્રામાં વધારો કરો અને ચક્રની સંખ્યા ઘટાડો.એનિલિંગ તાપમાનને યોગ્ય રીતે વધારવું અથવા બે તાપમાન બિંદુ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરો (93 ° સે ડીજનરેશન, એનિલિંગ અને લગભગ 65 ° સે પર વિસ્તરણ).

● ફ્લેકી ટો અથવા સ્મીયર ટેપ દેખાય છે

પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન કેટલીકવાર લાગુ અથવા શેલ અથવા કાર્પેટ-જેવો પટ્ટો દેખાય છે.કારણસર, ઉત્સેચકોની અતિશય માત્રા અથવા એન્ઝાઇમની નબળી ગુણવત્તાને લીધે, dNTP સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી છે, Mg2+ સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી છે, એનિલિંગ તાપમાન ખૂબ ઓછું છે, અને ચક્રની સંખ્યા ઘણી વધારે છે.પ્રતિકારક પગલાં છે: ① ઉત્સેચકોની માત્રામાં ઘટાડો, અથવા અન્ય સ્ત્રોતના એન્ઝાઇમને બદલો.②dNTP ની સાંદ્રતા ઘટાડવી ③યોગ્ય રીતે Mg2+ સાંદ્રતા ઘટાડવી.④ ટેમ્પલેટ્સની માત્રામાં વધારો અને ચક્રની સંખ્યા ઘટાડવી.

સંબંધિત વસ્તુઓ

PCR Heroᵀᴹ (રંગ સાથે)

◮ ઉચ્ચ વફાદારી: સામાન્ય Taq એન્ઝાઇમ કરતાં 6 ગણી;

◮ ઝડપી એમ્પ્લીફિકેશન ઝડપ

◮ વધુ નમૂના અનુકૂલનક્ષમતા

◮ ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા

◮ પર્યાવરણીય સહિષ્ણુતા વધુ મજબૂત છે: એક અઠવાડિયા માટે 37°C પર મૂકવામાં આવે છે, 90% થી વધુ પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે છે;

◮ તેમાં 5'→3' DNA પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ અને 5'→3' એક્સોનોક્લીઝ પ્રવૃત્તિ છે, 3'→5' એક્સોનોક્લીઝ પ્રવૃત્તિ વિના.

PCR Easyᴹ (રંગ સાથે)

અનન્ય પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી અને ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા Taq DNA પોલિમરેઝ PCR પ્રતિક્રિયાને ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા, વિશિષ્ટતા અને સંવેદનશીલતા બનાવે છે.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (એક પગલું)-SYBR ગ્રીન I

◮ વન-સ્ટેપ કીટ એક જ ટ્યુબમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને qPCR બે પ્રતિક્રિયાઓ બનાવે છે, માત્ર ટેમ્પલેટ RNA, ચોક્કસ PCR પ્રાઈમર્સ અને RNase-ફ્રી ddH ઉમેરવાની જરૂર છે.₂O.

◮ કીટ ઝડપથી અને અસરકારક રીતે વાયરલ RNAનું પૃથ્થકરણ કરી શકે છે અથવા RNA ને શોધી શકે છે.

◮ કિટ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને પ્રતિક્રિયાની વિશિષ્ટતાને અસરકારક રીતે સુધારવા માટે અનન્ય પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી સાથે સંયુક્ત ફોરજીન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રીએજન્ટ અને ફોરજીન હોટસ્ટાર ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે.

◮ ઑપ્ટિમાઇઝ રિએક્શન સિસ્ટમ પ્રતિક્રિયાને ઉચ્ચ તપાસ સંવેદનશીલતા, મજબૂત થર્મલ સ્થિરતા અને બહેતર સહનશીલતા બનાવે છે.

◮ RT-qPCR સરળ^TM(એક પગલું)-SYBR ગ્રીન I કિટ ROX ઇન્ટરનલ રેફરન્સ ડાઇ સાથે આવે છે, જેનો ઉપયોગ કુવાઓ વચ્ચે સિગ્નલ બેકગ્રાઉન્ડ અને સિગ્નલની ભૂલોને દૂર કરવા માટે કરી શકાય છે, જે ગ્રાહકોને માત્રાત્મક PCR સાધનોના વિવિધ મોડલમાં વાપરવા માટે અનુકૂળ છે.

RT સરળ^TMII (માસ્ટર પ્રિમિક્સ માટે માટે પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ સીડીએનએ સંશ્લેષણરીઅલ ટાઇમ પીસીઆર)

-gDNA દૂર કરવાની કાર્યક્ષમ ક્ષમતા, જે 2 મિનિટની અંદર નમૂનામાં gDNA દૂર કરી શકે છે.

-કાર્યક્ષમ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન સિસ્ટમ, તે પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ cDNA ના સંશ્લેષણને પૂર્ણ કરવામાં માત્ર 15 મિનિટ લે છે.

જટિલ નમૂનાઓ: ઉચ્ચ GC સામગ્રી અને જટિલ ગૌણ માળખું ધરાવતા નમૂનાઓ પણ ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા સાથે ઉલટાવી શકાય છે.

-ઉચ્ચ-સંવેદનશીલતા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સિસ્ટમ, પીજી-લેવલ ટેમ્પ્લેટ્સ પણ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળી સીડીએનએ મેળવી શકે છે.

-રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સિસ્ટમમાં ઉચ્ચ થર્મલ સ્થિરતા છે, શ્રેષ્ઠ પ્રતિક્રિયા તાપમાન 42℃ છે અને તે હજુ પણ 50℃ પર સારું રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રદર્શન ધરાવે છે.