પીસીઆર (પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન) એ ઇન-વિટ્રો ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન તકનીકોમાંની એક છે, જેનો ઇતિહાસ 30 વર્ષથી વધુ છે.

પીસીઆર ટેક્નોલોજી 1983માં યુએસએના સેટસના કેરી મુલિસે પાયોનિયર કરી હતી. મુલિસે 1985માં પીસીઆર પેટન્ટ માટે અરજી કરી હતી અને તે જ વર્ષે વિજ્ઞાન પર પ્રથમ પીસીઆર શૈક્ષણિક પેપર પ્રકાશિત કર્યું હતું.મુલિસને તેમના કાર્ય માટે 1993 માં રસાયણશાસ્ત્રમાં નોબેલ પુરસ્કાર આપવામાં આવ્યો હતો.

પીસીઆરના મૂળભૂત સિદ્ધાંતો

PCR લક્ષ્ય DNA ટુકડાઓને એક મિલિયન કરતા વધુ વખત વધારી શકે છે.સિદ્ધાંત ડીએનએ પોલિમરેઝના ઉત્પ્રેરક હેઠળ છે, એક ટેમ્પલેટ તરીકે પિતૃ સ્ટ્રાન્ડ ડીએનએનો ઉપયોગ કરીને અને વિસ્તરણ માટેના પ્રારંભિક બિંદુ તરીકે વિશિષ્ટ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરે છે.તે વિટ્રોમાં વિકૃતિકરણ, એનેલીંગ અને એક્સ્ટેંશન જેવા પગલાઓ દ્વારા નકલ કરવામાં આવે છે.પુત્રી સ્ટ્રાન્ડ ડીએનએની પ્રક્રિયા પિતૃ સ્ટ્રાન્ડ ટેમ્પલેટ ડીએનએ માટે પૂરક છે.

માનક પીસીઆર પ્રક્રિયાને ત્રણ તબક્કામાં વહેંચવામાં આવી છે:

1. ડિનેચરેશન: ડીએનએ ડબલ સ્ટ્રેન્ડને અલગ કરવા માટે ઉચ્ચ તાપમાનનો ઉપયોગ કરો.ડીએનએ ડબલ સેર વચ્ચેનો હાઇડ્રોજન બોન્ડ ઊંચા તાપમાને (93-98℃) તૂટી જાય છે.

2.એનીલિંગ: ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ અલગ થયા પછી, તાપમાન ઓછું કરો જેથી પ્રાઈમર સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ સાથે જોડાઈ શકે.

3. એક્સ્ટેંશન: જ્યારે તાપમાન ઓછું થાય છે ત્યારે ડીએનએ પોલિમરેઝ બંધાયેલા પ્રાઇમર્સમાંથી ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ સાથે પૂરક સેરનું સંશ્લેષણ કરવાનું શરૂ કરે છે.જ્યારે એક્સ્ટેંશન પૂર્ણ થાય છે, ત્યારે એક ચક્ર પૂર્ણ થાય છે, અને ડીએનએ ટુકડાઓની સંખ્યા બમણી થાય છે

આ ત્રણ પગલાંને 25-35 વખત વળતર આપવાથી, DNA ટુકડાઓની સંખ્યા ઝડપથી વધશે.

પીસીઆરની ચાતુર્ય એ છે કે વિવિધ પ્રાઈમર્સને વિવિધ લક્ષ્ય જનીનો માટે ડિઝાઇન કરી શકાય છે, જેથી લક્ષ્ય જનીન ટુકડાઓ ટૂંકા ગાળામાં વિસ્તૃત થઈ શકે.

અત્યાર સુધી, PCR ને ત્રણ શ્રેણીઓમાં વિભાજિત કરી શકાય છે, એટલે કે સામાન્ય PCR, ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR અને ડિજિટલ PCR.

સામાન્ય પીસીઆરની પ્રથમ પેઢી

લક્ષ્ય જનીનને વિસ્તૃત કરવા માટે સામાન્ય પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટનો ઉપયોગ કરો, અને પછી ઉત્પાદનને શોધવા માટે એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ કરો, માત્ર ગુણાત્મક વિશ્લેષણ કરી શકાય છે.

પ્રથમ પેઢીના પીસીઆરના મુખ્ય ગેરફાયદા:

1. બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન અને ખોટા સકારાત્મક પરિણામોની સંભાવના.

2. તપાસમાં લાંબો સમય લાગે છે અને ઓપરેશન બોજારૂપ છે.

3.ફક્ત ગુણાત્મક પરીક્ષણ કરી શકાય છે

બીજી પેઢીનું રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર

રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર, જેને qPCR તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તે ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સનો ઉપયોગ કરે છે જે પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની પ્રગતિને સૂચવી શકે છે, અને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલોના સંચય દ્વારા એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનોના સંચય પર નજર રાખે છે, અને ફ્લોરોસેન્સ કર્વ દ્વારા પરિણામોનું મૂલ્યાંકન કરે છે.તેને Cq મૂલ્ય અને પ્રમાણભૂત વળાંકની મદદથી પરિમાણ કરી શકાય છે.

કારણ કે qPCR ટેક્નોલોજી બંધ સિસ્ટમમાં હાથ ધરવામાં આવે છે, દૂષણની સંભાવના ઓછી થાય છે, અને જથ્થાત્મક તપાસ માટે ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલનું નિરીક્ષણ કરી શકાય છે, તેથી તે ક્લિનિકલ પ્રેક્ટિસમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાય છે અને તે PCRમાં પ્રબળ તકનીક બની ગઈ છે.

રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆરમાં વપરાતા ફ્લોરોસન્ટ પદાર્થોને આમાં વિભાજિત કરી શકાય છે: ટાકમેન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ, મોલેક્યુલર બેકોન્સ અને ફ્લોરોસન્ટ ડાય.

1)તકમાન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ:

PCR એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન, પ્રાઈમરની જોડી ઉમેરતી વખતે ચોક્કસ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ ઉમેરવામાં આવે છે.ચકાસણી એ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ છે, અને બંને છેડા રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને ક્વેન્ચર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ સાથે લેબલ થયેલ છે.

જ્યારે ચકાસણી અકબંધ હોય છે, ત્યારે રિપોર્ટર જૂથ દ્વારા ઉત્સર્જિત ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ શમન જૂથ દ્વારા શોષાય છે;પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન, ટાક એન્ઝાઇમની 5′-3′ એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ તપાસને ફાટી જાય છે અને ડિગ્રેડ કરે છે, જેનાથી રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને ક્વેન્ચર ફ્લોરોસન્ટ જૂથને અલગ કરવામાં આવે છે, જેથી ફ્લોરોસેન્સ મોનિટરિંગ સિસ્ટમ ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ પ્રાપ્ત કરી શકે, એટલે કે, દરેક વખતે એમ્પ્લીફિકેશન અને ડીએનએ ફ્લુઓનું સ્વરૂપ નક્કી કરવામાં આવે છે. ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલનું સંચય સંપૂર્ણપણે પીસીઆર ઉત્પાદનની રચના સાથે સિંક્રનાઇઝ થાય છે.

2) SYBR ફ્લોરોસન્ટ ડાઇ:

PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં, SYBR ફ્લોરોસન્ટ રંગનો વધુ પડતો ઉમેરો થાય છે.એસવાયબીઆર ફ્લોરોસન્ટ ડાઈને ડીએનએ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડમાં બિન-વિશિષ્ટ રીતે સમાવિષ્ટ કર્યા પછી, તે ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલનું ઉત્સર્જન કરે છે.SYBR ડાય પરમાણુ જે સાંકળમાં સમાવિષ્ટ નથી તે કોઈપણ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલનું ઉત્સર્જન કરશે નહીં, જેનાથી ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલની ખાતરી થાય છે. PCR ઉત્પાદનોમાં વધારો PCR ઉત્પાદનોના વધારા સાથે સંપૂર્ણપણે સુમેળમાં છે.SYBR માત્ર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA સાથે જોડાય છે, તેથી પીસીઆર પ્રતિક્રિયા ચોક્કસ છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે ગલન કર્વનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.

3) મોલેક્યુલર બીકન:

તે સ્ટેમ-લૂપ ડબલ-લેબલવાળી ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રોબ છે જે 5 અને 3 છેડે લગભગ 8 પાયાની હેરપિન માળખું બનાવે છે.બંને છેડે ન્યુક્લીક એસિડ સિક્વન્સ પૂરક રીતે જોડવામાં આવે છે, જેના કારણે ફ્લોરોસન્ટ જૂથ અને ક્વેન્ચિંગ જૂથ ચુસ્ત બને છે.બંધ કરો, કોઈ ફ્લોરોસેન્સ ઉત્પન્ન થશે નહીં.

પીસીઆર પ્રોડક્ટ જનરેટ થયા પછી, એનેલીંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન, મોલેક્યુલર બીકનનો મધ્ય ભાગ ચોક્કસ ડીએનએ ક્રમ સાથે જોડવામાં આવે છે, અને ફ્લોરોસન્ટ જનીનને ક્વેન્ચર જનીનથી અલગ કરવામાં આવે છે જેથી ફ્લોરોસેન્સ ઉત્પન્ન થાય.

બીજી પેઢીના પીસીઆરના મુખ્ય ગેરફાયદા:

સંવેદનશીલતા હજુ પણ અભાવ છે, અને ઓછી નકલ નમુનાઓની શોધ અચોક્કસ છે.

પૃષ્ઠભૂમિ મૂલ્યનો પ્રભાવ છે, અને પરિણામ દખલગીરી માટે સંવેદનશીલ છે.

જ્યારે પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં પીસીઆર અવરોધકો હોય છે, ત્યારે શોધ પરિણામો દખલ માટે સંવેદનશીલ હોય છે.

ત્રીજી પેઢીના ડિજિટલ પીસીઆર

ડિજિટલ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) અંતિમ-બિંદુ શોધ દ્વારા લક્ષ્ય ક્રમની નકલ નંબરની ગણતરી કરે છે, અને આંતરિક નિયંત્રણો અને પ્રમાણભૂત વળાંકોનો ઉપયોગ કર્યા વિના ચોક્કસ સંપૂર્ણ માત્રાત્મક તપાસ કરી શકે છે.

ડિજિટલ પીસીઆર અંતિમ બિંદુ શોધનો ઉપયોગ કરે છે અને તે Ct મૂલ્ય (સાયકલ થ્રેશોલ્ડ) પર આધાર રાખતું નથી, તેથી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા દ્વારા ડિજિટલ પીસીઆર પ્રતિક્રિયા ઓછી પ્રભાવિત થાય છે, અને ઉચ્ચ ચોકસાઈ અને પ્રજનનક્ષમતા સાથે, પીસીઆર પ્રતિક્રિયા અવરોધકોની સહનશીલતામાં સુધારો થાય છે.

ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને ઉચ્ચ સચોટતાની લાક્ષણિકતાઓને લીધે, તે PCR પ્રતિક્રિયા અવરોધકો દ્વારા સરળતાથી દખલ કરી શકતું નથી, અને તે પ્રમાણભૂત ઉત્પાદનો વિના સાચું સંપૂર્ણ પ્રમાણ પ્રાપ્ત કરી શકે છે, જે સંશોધન અને એપ્લિકેશનનું હોટસ્પોટ બની ગયું છે.

પ્રતિક્રિયા એકમના વિવિધ સ્વરૂપો અનુસાર, તેને ત્રણ મુખ્ય પ્રકારોમાં વિભાજિત કરી શકાય છે: માઇક્રોફ્લુઇડિક, ચિપ અને ડ્રોપલેટ સિસ્ટમ્સ.

1) માઇક્રોફ્લુઇડિક ડિજિટલ પીસીઆર, એમડીપીસીઆર:

માઇક્રોફ્લુઇડિક ટેક્નોલોજીના આધારે, ડીએનએ ટેમ્પલેટને અલગ કરવામાં આવે છે.માઇક્રોફ્લુઇડિક ટેક્નોલોજી સેમ્પલ નેનો-અપગ્રેડિંગ અથવા નાના ટીપાંના ઉત્પાદનને અનુભવી શકે છે, પરંતુ ટીપાંને ખાસ શોષણ પદ્ધતિની જરૂર છે અને પછી પીસીઆર પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ સાથે જોડવામાં આવે છે.એમડીપીસીઆર ધીમે ધીમે બદલવાની અન્ય પદ્ધતિઓ દ્વારા અપનાવવામાં આવી છે.

2) ડ્રોપલેટ આધારિત ડિજિટલ પીસીઆર, ડીડીપીસીઆર:

નમૂનાને ટીપાંમાં પ્રક્રિયા કરવા માટે વોટર-ઇન-ઓઇલ ટીપું જનરેશન ટેકનોલોજીનો ઉપયોગ કરો અને ન્યુક્લીક એસિડ પરમાણુ ધરાવતી પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીને હજારો નેનોસ્કેલ ટીપાઓમાં વિભાજિત કરો, જેમાંના દરેકમાં શોધવા માટે ન્યુક્લીક એસિડ લક્ષ્ય પરમાણુ શામેલ નથી, અથવા પરીક્ષણ કરવા માટે એકથી અનેક ન્યુક્લીક એસિડ લક્ષ્ય અણુઓ ધરાવે છે.

3) ચિપ આધારિત ડિજિટલ PCR, cdPCR:

સિલિકોન વેફર્સ અથવા ક્વાર્ટઝ ગ્લાસ પર ઘણી માઇક્રોટ્યુબ્સ અને માઇક્રોકેવિટીઝને કોતરવા માટે સંકલિત પ્રવાહી પાથવે ટેકનોલોજીનો ઉપયોગ કરો, અને વિવિધ નિયંત્રણ વાલ્વ દ્વારા દ્રાવણના પ્રવાહને નિયંત્રિત કરો, અને સંપૂર્ણ પ્રમાણ પ્રાપ્ત કરવા માટે ડિજિટલ PCR પ્રતિક્રિયા માટે પ્રતિક્રિયા કુવાઓમાં સમાન કદના નેનોમીટરમાં નમૂના પ્રવાહીને વિભાજીત કરો.

ત્રીજી પેઢીના પીસીઆરના મુખ્ય ગેરફાયદા:

સાધનો અને રીએજન્ટ ખર્ચાળ છે.

નમૂના ગુણવત્તા જરૂરિયાતો ઊંચી છે.જો ટેમ્પ્લેટ જથ્થો માઇક્રોસિસ્ટમ જથ્થા કરતાં વધી જાય, તો તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવું અશક્ય હશે, અને જો તે ખૂબ નાનું હોય, તો પરિમાણની ચોકસાઈમાં ઘટાડો થશે.

જ્યારે બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન હોય ત્યારે ખોટા હકારાત્મક પણ જનરેટ થઈ શકે છે.