COVID-19 એ ગંભીર એક્યુટ રેસ્પિરેટરી સિન્ડ્રોમ કોરોનાવાયરસ ટાઈપ 2 ને કારણે થતો ચેપી રોગ છે. જ્યારે કોઈ વ્યક્તિને ચેપ લાગે છે, ત્યારે સૌથી સામાન્ય લક્ષણોમાં તાવ, ઉધરસ અને શ્વાસ લેવામાં તકલીફનો સમાવેશ થાય છે.

પરીક્ષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા નમૂનાઓ નેસોફેરિંજલ સ્વેબ અથવા ઓરોફેરિન્જલ સ્વેબ દ્વારા એકત્રિત કરી શકાય છે.

PCR શું છે?

કોરોનાવાયરસ તપાસની પ્રમાણભૂત પદ્ધતિ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન, પીસીઆર છે.આ મોલેક્યુલર બાયોલોજીમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે.તે ઝડપથી લાખોથી અબજો ચોક્કસ DNA ટુકડાઓની નકલ કરી શકે છે.

નવા કોરોનાવાયરસમાં ખૂબ લાંબા સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ RNA જીનોમ છે.પીસીઆર દ્વારા આ વાયરસને શોધવા માટે, આરએનએ અણુઓને તેમના પૂરક ડીએનએ સિક્વન્સમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ દ્વારા રૂપાંતરિત કરવું આવશ્યક છે, અને પછી નવા સંશ્લેષિત ડીએનએને પ્રમાણભૂત પીસીઆર પ્રક્રિયાઓ દ્વારા વિસ્તૃત કરી શકાય છે, જે સામાન્ય રીતે આરટી-પીસીઆર તરીકે ઓળખાય છે.

RT-PCR પ્રક્રિયા

આરએનએ નિષ્કર્ષણ

આ પદ્ધતિ કરવા માટે, વાયરલ આરએનએ મૂળભૂત રીતે કાઢવામાં આવે છે.વિવિધ RNA શુદ્ધિકરણ કીટનો ઉપયોગ અનુકૂળ, ઝડપી અને અસરકારક રીતે અલગ કરવા માટે કરી શકાય છે.

કોમર્શિયલ કીટનો ઉપયોગ કરીને વાયરલ RNA કાઢવા માટે, પ્રથમ નમૂનાને માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં ઉમેરો અને પછી તેને લિસિસ બફર સાથે મિક્સ કરો.આ બફર ખૂબ જ વિકૃત છે અને તેમાં સામાન્ય રીતે ફિનોલ અને ગુઆનીડીન આઇસોથિયોસાયનેટ હોય છે.વધુમાં, RNase અવરોધકો સામાન્ય રીતે અકબંધ વાયરલ આરએનએના અલગતાને સુનિશ્ચિત કરવા માટે લિસિસ બફરમાં હાજર હોય છે.

લિસિસ બફર ઉમેર્યા પછી, મિશ્રણ ટ્યુબને પલ્સ દ્વારા વમળ કરો અને ઓરડાના તાપમાને ઉકાળો.પછી વાયરસને લિસિસ બફર દ્વારા પૂરી પાડવામાં આવેલ અત્યંત વિકૃત પરિસ્થિતિઓ હેઠળ લાઇસેસ કરવામાં આવે છે.

નમૂનાને લીસ કર્યા પછી, શુદ્ધિકરણ પ્રક્રિયા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.સેમ્પલને સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં લોડ કરવામાં આવે છે અને પછી સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવે છે.

આ પ્રક્રિયા એક નક્કર તબક્કાની નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ છે જેમાં સ્થિર તબક્કામાં સિલિકા જેલ મેટ્રિક્સનો સમાવેશ થાય છે.

શ્રેષ્ઠ મીઠું અને pH શરતો હેઠળ, RNA અણુઓ સિલિકા પટલ સાથે જોડાય છે.

તે જ સમયે, પ્રોટીન અને અન્ય દૂષકો દૂર કરવામાં આવે છે.

સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબને ક્લીન કલેક્શન ટ્યુબમાં નાખો, ફિલ્ટ્રેટ કાઢી નાખો અને પછી વોશિંગ બફર ઉમેરો.

પટલ દ્વારા વોશ બફરને દબાણ કરવા માટે ફરીથી સેન્ટ્રીફ્યુજમાં ટ્યુબ મૂકો.આ પટલમાંથી બાકીની બધી અશુદ્ધિઓને દૂર કરશે, ફક્ત આરએનએ સિલિકા જેલ સાથે બંધાયેલ છોડી દેશે.

નમૂના ધોવાઇ ગયા પછી, ટ્યુબને સ્વચ્છ માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં મૂકો અને ઇલ્યુશન બફર ઉમેરો.

તે પછી પટલ દ્વારા ઇલ્યુશન બફરને દબાણ કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવે છે.ઇલ્યુશન બફર સ્પિન કોલમમાંથી વાયરલ આરએનએ દૂર કરે છે અને પ્રોટીન, અવરોધકો અને અન્ય દૂષણોથી મુક્ત આરએનએ મેળવે છે.

પગલું 2

મિશ્ર સાંદ્ર

વાયરલ આરએનએ બહાર કાઢ્યા પછી, આગળનું પગલું પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન માટે પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ તૈયાર કરવાનું છે.આ પગલામાં, એકાગ્રતાનો ઉપયોગ થાય છે.આ કેન્દ્રિત સોલ્યુશન એ પ્રિમિક્સ, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, ન્યુક્લિયોટાઈડ્સ, ફોરવર્ડ પ્રાઈમર, રિવર્સ પ્રાઈમર, ટાકમેન પ્રોબ અને ડીએનએ પોલિમરેઝનો સમાવેશ થાય છે.

છેલ્લે, આ પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને પૂર્ણ કરવા માટે, RNA ટેમ્પલેટ ઉમેરવામાં આવે છે.ટ્યુબને પલ્સ વોર્ટેક્સીંગ દ્વારા મિશ્રિત કરવામાં આવે છે, અને પછી પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ પીસીઆર પ્લેટમાં લોડ થાય છે.PCR પ્લેટમાં સામાન્ય રીતે 96 કૂવા હોય છે અને તે એક જ સમયે અનેક નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરી શકે છે.

પગલું 3

પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન

આગળ, પ્લેટને પીસીઆર મશીનમાં મૂકો, જે આવશ્યકપણે થર્મલ સાયકલ છે.

રીઅલ-ટાઇમ RT-PCR નો ઉપયોગ RdrRP જનીન, E જનીન અને N જનીનમાં લક્ષ્ય ક્રમને વિસ્તૃત કરીને 2019 નવલકથા કોરોનાવાયરસને શોધવા માટે થાય છે.લક્ષ્ય જનીનની પસંદગી પ્રાઈમર અને પ્રોબ ક્રમ પર આધારિત છે.

RT-PCRનું પ્રથમ પગલું રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન છે.પૂરક ડીએનએનો પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે, જે પીસીઆર રિવર્સ પ્રાઈમર દ્વારા શરૂ કરવામાં આવે છે, જે વાયરલ આરએનએ જીનોમના પૂરક ભાગ સાથે જોડાય છે.પછી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ વાયરલ આરએનએના પૂરક ડીએનએનું સંશ્લેષણ કરવા માટે પ્રાઈમરના 3′છેડામાં DNA ન્યુક્લિયોટાઈડ ઉમેરે છે.આ પગલાનું તાપમાન અને અવધિ પ્રાઈમર, લક્ષ્ય આરએનએ અને ઉપયોગમાં લેવાતા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ પર આધારિત છે.

આગળ, પ્રારંભિક વિકૃતિકરણ પગલું લાગુ કરવામાં આવે છે, જે RNA-DNA હાઇબ્રિડના વિકૃતીકરણમાં પરિણમે છે.ડીએનએ પોલિમરેઝને સક્રિય કરવા માટે આ પગલું જરૂરી છે.તે જ સમયે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ નિષ્ક્રિય છે.

પીસીઆર થર્મલ ચક્રની શ્રેણી ધરાવે છે.દરેક ચક્રમાં વિકૃતિકરણ, એનેલીંગ અને એક્સ્ટેંશન સ્ટેપ્સનો સમાવેશ થાય છે.

ડિનેચરેશન સ્ટેપમાં રિએક્શન ચેમ્બરને 95 ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી ગરમ કરવું અને ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટેમ્પલેટના વિકૃતીકરણ માટે તેનો ઉપયોગ કરવાનો સમાવેશ થાય છે.

આગળના પગલામાં, પ્રતિક્રિયા તાપમાન ઘટાડીને 58 ડિગ્રી સેલ્સિયસ કરવામાં આવે છે, જે ફોરવર્ડ પ્રાઈમરને તેના સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટેમ્પ્લેટના પૂરક ભાગ સાથે જોડવાની મંજૂરી આપે છે.એન્નીલિંગ તાપમાન પ્રાઈમરની લંબાઈ અને રચના પર સીધો આધાર રાખે છે.

એક્સ્ટેંશન સ્ટેપમાં, ડીએનએ પોલિમરેઝ નવા ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરે છે જે ડીએનએ ટેમ્પલેટ સ્ટ્રાન્ડને પૂરક છે.પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાંથી 5′થી 3′દિશામાં નમૂનામાં પૂરક મુક્ત ન્યુક્લી ઉમેરીને.આ પગલાનું તાપમાન વપરાયેલ ડીએનએ પોલિમરેઝ પર આધારિત છે.

પ્રથમ ચક્ર પછી, ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ લક્ષ્ય પ્રાપ્ત થાય છે.

પછી, બીજું ચક્ર દાખલ કરો.ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ બે સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ પરમાણુઓ ઉત્પન્ન કરવા માટે વિકૃત છે.

આગળના પગલામાં, પ્રતિક્રિયાનું તાપમાન ઓછું કરવામાં આવે છે, દરેક સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટેમ્પ્લેટ સાથે પ્રાઈમર્સને જોડવામાં આવે છે, અને ટાક-મેન પ્રોબને લક્ષ્ય ડીએનએના પૂરક ભાગ સાથે જોડવામાં આવે છે.

TaqMan પ્રોબમાં ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રોબના 5′એન્ડ સાથે સહસંયોજક રીતે જોડાયેલા ફ્લોરોફોરનો સમાવેશ થાય છે.જ્યારે સાયકલરના પ્રકાશ સ્ત્રોત દ્વારા ઉત્સાહિત થાય છે, ત્યારે ફ્લોરોફોર ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન કરે છે.વધુમાં, ચકાસણી 3′એન્ડ પર ક્વેન્ચરથી બનેલી છે.ક્વેન્ચર માટે રિપોર્ટર જનીનની નિકટતા ફ્લોરોસેન્સની શોધને અટકાવે છે.

એક્સ્ટેંશન સ્ટેપમાં, ડીએનએ પોલિમરેઝ નવી સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરે છે.જ્યારે પોલિમરેઝ TaqMan પ્રોબ સુધી પહોંચે છે, ત્યારે તેની એન્ડોજેનસ 5′ન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ તપાસને ચીરી નાખે છે, ડાઈને ક્વેન્ચરથી અલગ કરે છે.

પીસીઆરના દરેક ચક્ર સાથે, વધુ રંગના અણુઓ બહાર આવે છે, જેના પરિણામે સંશ્લેષિત એમ્પ્લિકન્સની સંખ્યાના પ્રમાણમાં ફ્લોરોસેન્સની તીવ્રતામાં વધારો થાય છે.

આ પદ્ધતિ નમૂનામાં હાજર આપેલ ક્રમની સંખ્યાનો અંદાજ કાઢવા માટે પરવાનગી આપે છે.દરેક ચક્રમાં ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટુકડાઓની સંખ્યા બમણી થાય છે.તેથી, પીસીઆરનો ઉપયોગ ખૂબ જ નાના નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવા માટે થઈ શકે છે.

ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ માપવા માટે, ટંગસ્ટન હેલોજન લેમ્પ, ઉત્તેજના ફિલ્ટર, રિફ્લેક્ટર, લેન્સ, એમિશન ફિલ્ટર અને ચાર્જ કમ્પલ્ડ ડીવાઈસ-ઉપયોગ CCD કેમેરા.

પગલું 4 શોધો

ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ માપવા માટે, ટંગસ્ટન હેલોજન લેમ્પ, ઉત્તેજના ફિલ્ટર, રિફ્લેક્ટર, લેન્સ, એમિશન ફિલ્ટર અને ચાર્જ કમ્પલ્ડ ડીવાઈસ-ઉપયોગ CCD કેમેરા.

લેમ્પમાંથી ફિલ્ટર કરેલ પ્રકાશ પરાવર્તક દ્વારા પ્રતિબિંબિત થાય છે, કન્ડેન્સર લેન્સમાંથી પસાર થાય છે અને દરેક છિદ્રના કેન્દ્રમાં કેન્દ્રિત હોય છે.પછી છિદ્રમાંથી ઉત્સર્જિત ફ્લોરોસેન્સ અરીસામાંથી પ્રતિબિંબિત થાય છે, ઉત્સર્જન ફિલ્ટરમાંથી પસાર થાય છે અને CCD કેમેરા દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવે છે.દરેક પીસીઆર ચક્રમાં, સ્વયં-ઉત્તેજિત ફ્લોરોફોર પ્રકાશ CCD દ્વારા શોધી શકાય છે.

તે કેપ્ચર કરેલા પ્રકાશને ડિજિટલ ડેટામાં રૂપાંતરિત કરે છે.આ પદ્ધતિને રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર કહેવામાં આવે છે, અને તે પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની પ્રગતિનું રીઅલ-ટાઇમ મોનિટરિંગ કરવાની મંજૂરી આપે છે.