દરેક જણ qRT-PCR પ્રયોગના સિદ્ધાંત, પ્રાઈમર ડિઝાઇન, પરિણામ અર્થઘટન વગેરે વિશે વાત કરે છે, પરંતુ મને લાગે છે કે મારે તમારી સાથે qRT-PCRની પ્રાયોગિક કામગીરી શેર કરવી જોઈએ.તે નાનું છે, પરંતુ તે પરિણામો વિશે છે.
qRT-PCR કરતા પહેલા, આપણે આપણા પોતાના RNA અને ઓપરેશનની પદ્ધતિઓની સ્પષ્ટ સમજણ હોવી જરૂરી છે.છેવટે, અમારા પ્રયત્નોનો હેતુ ફક્ત પ્રેક્ટિસ કરવાને બદલે પરિણામ મેળવવાનો છે.તેથી qRT-PCR કરતા પહેલા, અમારે નીચેના મુદ્દાઓ નક્કી કરવાની જરૂર છે (જેમાંથી કેટલીક માત્ર SYBR ને જ લાગુ પડે છે).
1 શું તમને ખાતરી છે કે તમારું આરએનએ બગડ્યું નથી?
NanoDrop 2000 માત્ર RNA ની સાંદ્રતા અને શુદ્ધતા શોધી શકે છે, પરંતુ RNA ની અખંડિતતાને શોધી શકતું નથી.
આરએનએ (આરએનએ ઇન્ટેસિટી નંબર) મૂલ્ય આરએનએની અખંડિતતાને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે, જે એજિલેન્ટ 2100 બાયોએનાલાઇઝર સિસ્ટમ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવે છે.
ફિગ. વિવિધ RNA નમૂનાઓ (યુકેરીયોટ્સ) માટે RIN મૂલ્યોની યોજનાકીય રેખાકૃતિ
જો કે, પ્રયોગશાળાઓમાં સામાન્ય રીતે એજિલેન્ટ 2100 બાયોએનાલાઈઝર હોતું નથી.આ કિસ્સામાં, અમે ફોર્માલ્ડિહાઇડ જેલ દ્વારા શોધી શકીએ છીએ, પરંતુ આરએનએની કુલ રકમની જરૂરિયાત વધારે છે, તેથી સૌથી ઝડપી પદ્ધતિ સામાન્ય જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસનો ઉપયોગ કરવાની છે.તે ન્યુક્લિઝ-મુક્ત વાતાવરણમાં હોવું જરૂરી છે, તેથી ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ ટાંકી, સોલ બોટલ, જેલ કૌંસ અને DEPC પાણીથી કાંસકો કોગળા કરવા જરૂરી છે.એગેરોઝ ન્યુક્લિઝ-મુક્ત પણ છે (જ્યાં સુધી તે તાજી ખોલવામાં આવે ત્યાં સુધી), અને લોડિંગ બફર 1.2% જેલ સાથે શક્ય તેટલું તાજું ખોલવું જોઈએ.
નોંધ કરો કે જેલ સંપૂર્ણપણે ઓગળી જવી જોઈએ, અન્યથા તે અસંગત બેન્ડ્સનું કારણ બનશે, જેમ કે આકૃતિમાં નમૂના 9 માં બતાવ્યા પ્રમાણે.જો વોલ્ટેજ ખૂબ ઊંચું હોય અથવા ખૂબ લાંબા સમય સુધી ચાલતું હોય તો તે ગરમી ઉત્પન્ન કરે છે અને આરએનએનું અધોગતિનું કારણ બને છે, તેથી વોલ્ટેજ અને સમયને વ્યાજબી રીતે નિયંત્રિત કરવું જોઈએ.વધુમાં, જેલ ચલાવવાથી એ પણ નક્કી કરી શકાય છે કે નમૂનામાં ડીએનએ અવશેષો છે કે કેમ, અને અવલોકન કરી શકે છે કે વિતરણ કૂવામાં મોટી સંખ્યામાં જાળવી રાખેલા બેન્ડ છે કે કેમ.
આંકડો.આરએનએની જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ શોધ
2 શું તમે તમારા cDNA ની સાંદ્રતા વિશે ચોક્કસ છો?
પ્રયોગશાળામાં મોટા ભાઈઓનો અનુભવ એ છે કે દરેક વ્યુત્ક્રમ દ્વારા મેળવેલી 20 ul સિસ્ટમની સીડીએનએ સીધી 20X પાતળી થાય છે, જ્યારે પોસ્ટ-ડોક્ટરલ બહેનોને 10X પાતળું કરવામાં આવે છે.હું સામાન્ય રીતે પરિસ્થિતિ પર આધાર રાખું છું.કારણ કે દરેક વ્યક્તિ દ્વારા ઉલ્લેખિત આરએનએની ગુણવત્તા અલગ છે, રિવર્સલનું સ્તર પણ અલગ છે, અને રિવર્સલ ટેક્નોલોજી સ્થિર ન પણ હોઈ શકે.
તેથી જ્યારે પણ મને વિપરીત cDNA મળશે, ત્યારે હું તેને લગભગ 3 વખત પાતળું કરીશ, અને પછી RT-PCR કરવા માટે હાઉસકીપિંગ જનીનનો ઉપયોગ કરીશ, ચોક્કસ સાંદ્રતાને ઓળખવા માટે, ચક્રની સંખ્યા સામાન્ય રીતે 25 ચક્ર હોય છે, અને પછી અંતિમ મંદન પરિબળ નક્કી કરીશ.
3 શું તમને ખાતરી છે કે તમારા પ્રાઇમર્સ વાપરવા માટે સરળ છે?
તે qRT-PCR ના મેલ્ટિંગ કર્વને પસાર કરી શકે છે, પરંતુ આ માટે હજુ પણ પૈસા ખર્ચ થાય છે.ઘણા પૈસા વગરની પ્રયોગશાળાઓ માટે, જ્યારે તેઓને ઘણા બધા પ્રાઈમર મળે છે, ત્યારે તેઓ સામાન્ય RT-PCR નો ઉપયોગ કરી શકે છે કે તે એક બેન્ડ છે કે કેમ અને પ્રાઇમરની વિશિષ્ટતા ઓળખી શકે છે.જો પ્રયોગશાળામાં પૈસાની અછત ન હોય, તો ગલન કર્વ દ્વારા તમામ પ્રાઇમરની વિશિષ્ટતા એકવાર ઓળખી શકાય છે.
4 શું તમને ખાતરી છે કે તમારી પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ યોગ્ય છે?
SYBR ને મજબૂત પ્રકાશથી સુરક્ષિત રાખવું જોઈએ, તેથી SYBR રીએજન્ટ ઉમેરતી વખતે ઓવરહેડ લાઇટને બંધ કરવાનો પ્રયાસ કરો અને તેને પૂર્ણ કરવા માટે માત્ર મંદ પ્રકાશનો ઉપયોગ કરવાની જરૂર છે.
SYBR ને 4°C પર સ્ટોર કરો.ઉપયોગમાં લેવાતી વખતે, ફીણ ન આવે તે માટે સારી રીતે ભળી જવા માટે ધીમેથી ઉપર અને નીચે ઊંધું કરો અને જોરશોરથી વમળ ન કરો.
કેટલીક નાની બહેનો નમૂનાઓ મિશ્રિત થવાના ડરથી પીસીઆર બોર્ડ પર માર્ક્સ દોરવાનું પસંદ કરે છે, જે ખોટું છે.કારણ કે તમારા માર્કર્સ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલોના સંગ્રહને અસર કરે તેવી શક્યતા છે, હું સામાન્ય રીતે જુનિયરોને મેમરીમાં મદદ કરવા માટે પ્રાયોગિક નોટબુકનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરું છું, નીચે બતાવ્યા પ્રમાણે.
આંકડો.qRT-PCR સેમ્પલ લોડિંગ ડાયાગ્રામ
5 શું તમને ખાતરી છે કે તમે તે બરાબર કરી રહ્યા છો?
મોજા પહેરવાની ખાતરી કરો, મોજા પહેરો, મોજા પહેરો અને મહત્વપૂર્ણ વસ્તુઓ ત્રણ વખત બોલો.
SYBR ના પ્રકાશના સંપર્કમાં ઘટાડો કરવા માટે, નીચેની આકૃતિમાં બતાવ્યા પ્રમાણે, હું વ્યક્તિગત રીતે પ્રથમ ટેમ્પલેટ ઉમેરવાનું પસંદ કરું છું.અનુભવ મુજબ, નમૂનાની થોડી માત્રા ઉમેરવાથી નમૂનાની ભૂલો થવાની સંભાવના છે.તેથી, ટેમ્પલેટની થોડી માત્રા ઉમેરવાથી થતી ભૂલને ઘટાડવા માટે, હું સામાન્ય રીતે નમૂનાને ફરીથી બમણું કરું છું, અને ઉમેરાયેલ H2O2 ની માત્રા ઘટાડવા માટે નમૂના ઉમેરતી વખતે બમણી રકમ કરું છું.
આંકડો.qRT-PCR લોડિંગની યોજનાકીય રેખાકૃતિ
પછી નીચે પ્રમાણે qRT-PCR સિસ્ટમ ગોઠવો.
આંકડો.qRT-PCR સિસ્ટમ તૈયારી ડાયાગ્રામ
નોંધ: રૂપરેખાંકન પ્રક્રિયા બરફ પર કરવાની જરૂર છે.
નમૂના ઉમેર્યા પછી, પારદર્શક સીલિંગ ફિલ્મ પેસ્ટ કરો.તમારા હાથથી પારદર્શક સીલિંગ ફિલ્મની સપાટીને સ્પર્શ ન કરવાનો પ્રયાસ કરો, ફક્ત ફિલ્મની બંને બાજુની જગ્યામાંથી કાર્ય કરો.કારણ કે ફિંગરપ્રિન્ટ્સ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલના સંગ્રહને પણ અસર કરી શકે છે.પછી સેમ્પલને દિવાલ પર લટકતા અટકાવવા માટે ઓછી ઝડપે 10 સેકન્ડ માટે ઝડપથી સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુજનો ઉપયોગ કરો.
સંબંધિત વસ્તુઓ:
પોસ્ટ સમય: એપ્રિલ-28-2023
