RT-qPCR સામાન્ય પીસીઆર ટેક્નોલોજીથી વિકસાવવામાં આવી છે.તે પરંપરાગત પીસીઆર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ફ્લોરોસન્ટ રસાયણો (ફ્લોરોસન્ટ ડાયઝ અથવા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સ) ઉમેરે છે, અને તેમની વિવિધ લ્યુમિનેસન્ટ મિકેનિઝમ્સ અનુસાર વાસ્તવિક સમયમાં પીસીઆર એન્નીલિંગ અને એક્સ્ટેંશન પ્રક્રિયાને શોધી કાઢે છે.માધ્યમમાં ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ ફેરફારોનો ઉપયોગ પીસીઆરના દરેક ચક્રમાં ઉત્પાદન ફેરફારની માત્રાની ગણતરી કરવા માટે થાય છે.હાલમાં, સૌથી સામાન્ય પદ્ધતિઓ ફ્લોરોસન્ટ ડાય પદ્ધતિ અને ચકાસણી પદ્ધતિ છે.

ફ્લોરોસન્ટ રંગ પદ્ધતિ:
કેટલાક ફ્લોરોસન્ટ રંગો, જેમ કે SYBR ગ્રીન Ⅰ, પીકોગ્રીન, BEBO, વગેરે, પોતાની જાતે પ્રકાશ ઉત્સર્જિત કરતા નથી, પરંતુ dsDNA ના નાના ગ્રુવ સાથે જોડાયા પછી ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન કરે છે.તેથી, પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની શરૂઆતમાં, મશીન ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ શોધી શકતું નથી.જ્યારે પ્રતિક્રિયા એનિલિંગ-એક્સ્ટેંશન (બે-પગલાની પદ્ધતિ) અથવા એક્સ્ટેંશન સ્ટેજ (ત્રણ-પગલાની પદ્ધતિ) તરફ આગળ વધે છે, ત્યારે આ સમયે ડબલ સ્ટ્રેન્ડ ખોલવામાં આવે છે, અને નવા ડીએનએ પોલિમરેઝ સ્ટ્રાન્ડ સંશ્લેષણ દરમિયાન, ફ્લોરોસન્ટ પરમાણુઓ dsDNA માઇનોર ગ્રુવમાં સંયોજિત થાય છે અને ફ્લુરેન્સ ફ્લુરેન્સ બહાર કાઢે છે.જેમ જેમ પીસીઆર ચક્રની સંખ્યામાં વધારો થાય છે તેમ, વધુ અને વધુ રંગો dsDNA સાથે જોડાય છે, અને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ પણ સતત ઉન્નત થાય છે.ઉદાહરણ તરીકે SYBR ગ્રીન Ⅰ લો.
તપાસ પદ્ધતિ:
તાકમાન પ્રોબ એ સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી હાઇડ્રોલિસિસ પ્રોબ છે.ચકાસણીના 5′ છેડે ફ્લોરોસન્ટ જૂથ છે, સામાન્ય રીતે FAM.ચકાસણી પોતે લક્ષ્ય જનીન માટે પૂરક ક્રમ છે.ફ્લોરોફોરના 3′ છેડે ફ્લોરોસન્ટ શમન જૂથ છે.ફ્લોરોસેન્સ રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર (Förster રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર, FRET) ના સિદ્ધાંત અનુસાર, જ્યારે રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ (દાતા ફ્લોરોસન્ટ પરમાણુ) અને ક્વેન્ચિંગ ફ્લોરોસન્ટ જૂથ (સ્વીકારક ફ્લોરોસન્ટ પરમાણુ) જ્યારે ઉત્તેજના સ્પેક્ટ્રમ ઓવરલેપ થાય છે અને અંતર ખૂબ જ નજીક હોય છે, ત્યારે એક્સિટેશન સ્પેક્ટ્રમ 100 ની નજીક હોય છે. સ્વીકારનાર પરમાણુનું ફ્લોરોસેન્સ, જ્યારે ઓટોફ્લોરોસેન્સ નબળું પડી ગયું છે.તેથી, પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની શરૂઆતમાં, જ્યારે ચકાસણી સિસ્ટમમાં મુક્ત અને અખંડ હોય છે, ત્યારે રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ ફ્લોરોસેન્સનું ઉત્સર્જન કરશે નહીં.જ્યારે એનેલીંગ કરવામાં આવે છે, ત્યારે પ્રાઈમર અને પ્રોબ ટેમ્પલેટ સાથે જોડાય છે.વિસ્તરણ તબક્કા દરમિયાન, પોલિમરેઝ સતત નવી સાંકળોનું સંશ્લેષણ કરે છે.DNA પોલિમરેઝમાં 5′-3′ exonuclease પ્રવૃત્તિ છે.જ્યારે ચકાસણી સુધી પહોંચે છે, ત્યારે ડીએનએ પોલિમરેઝ ટેમ્પલેટમાંથી પ્રોબને હાઇડ્રોલાઈઝ કરશે, રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથને ક્વેન્ચર ફ્લોરોસન્ટ જૂથથી અલગ કરશે અને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ છોડશે.ચકાસણી અને ટેમ્પ્લેટ વચ્ચે એક-થી-એક સંબંધ હોવાથી, ચકાસણીની ચોકસાઈ અને સંવેદનશીલતાના સંદર્ભમાં ચકાસણી પદ્ધતિ રંગ પદ્ધતિ કરતાં શ્રેષ્ઠ છે.

ફિગ 1 qRT-PCR નો સિદ્ધાંત

પ્રાઈમર ડિઝાઇન
સિદ્ધાંતો:

પ્રાઇમર્સ ન્યુક્લીક એસિડ શ્રેણીના સંરક્ષિત પ્રદેશમાં ડિઝાઇન કરવા જોઈએ અને તેની વિશિષ્ટતા હોવી જોઈએ.

cDNA ક્રમનો ઉપયોગ કરવો શ્રેષ્ઠ છે, અને mRNA ક્રમ પણ સ્વીકાર્ય છે.જો નહિં, તો ડીએનએ ક્રમની સીડીએસ ક્ષેત્રની ડિઝાઇન શોધો.
ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક ઉત્પાદનની લંબાઈ 80-150bp છે, સૌથી લાંબી 300bp છે, પ્રાઈમરની લંબાઈ સામાન્ય રીતે 17-25 બેઝ વચ્ચે હોય છે, અને અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઈમર વચ્ચેનો તફાવત ખૂબ મોટો ન હોવો જોઈએ.

G+C સામગ્રી 40% અને 60% ની વચ્ચે છે, અને 45-55% શ્રેષ્ઠ છે.
TM મૂલ્ય 58-62 ડિગ્રી વચ્ચે છે.
પ્રાઈમર ડાઇમર્સ અને સેલ્ફ-ડાઇમર્સને ટાળવાનો પ્રયાસ કરો, (સળંગ પૂરક પાયાના 4 જોડીથી વધુ ન દેખાય) હેરપિનનું માળખું, જો અનિવાર્ય હોય, તો ΔG<4.5kJ/mol* બનાવો જો તમે ખાતરી ન કરી શકો કે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન દરમિયાન gDNA દૂર કરવામાં આવ્યું છે, તો ઇન્ટ્રોનના પ્રાઇમર્સને ડિઝાઇન કરવું શ્રેષ્ઠ છે, GAT મોડને ટાળી શકાય નહીં, GAT ′ 3 ને ટાળી શકાય. /C, A/G સતત માળખું (2-3) પ્રાઇમર્સ અને બિન-
વિશિષ્ટ વિજાતીય રીતે એમ્પ્લીફાઇડ સિક્વન્સની હોમોલોજી પ્રાધાન્ય 70% કરતા ઓછી છે અથવા 8 પૂરક બેઝ હોમોલોજી ધરાવે છે.
ડેટાબેઝ:
કીવર્ડ્સ દ્વારા કોટનએફજીડી શોધ
પ્રાઈમર ડિઝાઇન:
IDT-qPCR પ્રાઈમર ડિઝાઇન

Fig2 IDT ઓનલાઇન પ્રાઇમર ડિઝાઇન ટૂલ પેજ

Fig3 પરિણામ પૃષ્ઠ પ્રદર્શન
lncRNA પ્રાઈમર્સની ડિઝાઇન:
lncRNA:mRNA જેવા જ પગલાં.
miRNA:સ્ટેમ-લૂપ પદ્ધતિનો સિદ્ધાંત: બધા miRNA લગભગ 23 nt ના ટૂંકા ક્રમ હોવાથી, ડાયરેક્ટ પીસીઆર શોધ કરી શકાતી નથી, તેથી સ્ટેમ-લૂપ સિક્વન્સ ટૂલનો ઉપયોગ થાય છે.સ્ટેમ-લૂપ સિક્વન્સ લગભગ 50 એનટીનું સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ છે, જે જાતે જ હેરપિનનું માળખું બનાવી શકે છે.3 'અંતને miRNA આંશિક ટુકડાના પૂરક ક્રમ તરીકે ડિઝાઇન કરી શકાય છે, પછી લક્ષ્ય miRNA ને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન દરમિયાન સ્ટેમ-લૂપ સિક્વન્સ સાથે જોડી શકાય છે, અને કુલ લંબાઈ 70bp સુધી પહોંચી શકે છે, જે qPCR દ્વારા નિર્ધારિત એમ્પ્લીફાઇડ પ્રોડક્ટની લંબાઈને અનુરૂપ છે.ટેલિંગ miRNA પ્રાઈમર ડિઝાઇન.
એમ્પ્લીફિકેશન-વિશિષ્ટ શોધ:
ઓનલાઈન બ્લાસ્ટ ડેટાબેઝ: કોટનએફજીડી ક્રમ સમાનતા દ્વારા બ્લાસ્ટ
સ્થાનિક બ્લાસ્ટ: સ્થાનિક બ્લાસ્ટ કરવા માટે Blast+ નો ઉપયોગ કરો, linux અને macos સીધા સ્થાનિક ડેટાબેઝ સ્થાપિત કરી શકે છે, win10 સિસ્ટમ ઉબુન્ટુ બેશ ઇન્સ્ટોલ કર્યા પછી પણ કરી શકાય છે.સ્થાનિક બ્લાસ્ટ ડેટાબેઝ અને સ્થાનિક બ્લાસ્ટ બનાવો;Win10 પર ઉબુન્ટુ બેશ ખોલો.
નોટિસ: અપલેન્ડ કપાસ અને દરિયાઈ ટાપુ કપાસ ટેટ્રાપ્લોઇડ પાક છે, તેથી વિસ્ફોટનું પરિણામ ઘણીવાર બે અથવા વધુ મેચ હશે.ભૂતકાળમાં, બ્લાસ્ટ કરવા માટે ડેટાબેઝ તરીકે NAU cds નો ઉપયોગ કરવાથી માત્ર થોડા SNP તફાવતો સાથે બે હોમોલોગસ જનીનો મળવાની શક્યતા છે.સામાન્ય રીતે, બે હોમોલોગસ જનીનોને પ્રાઈમર ડિઝાઇન દ્વારા અલગ કરી શકાતા નથી, તેથી તેઓને સમાન ગણવામાં આવે છે.જો ત્યાં સ્પષ્ટ ઈન્ડેલ હોય, તો પ્રાઈમર સામાન્ય રીતે ઈન્ડેલ પર ડિઝાઇન કરવામાં આવે છે, પરંતુ આ પ્રાઈમરની ગૌણ રચના તરફ દોરી શકે છે મુક્ત ઊર્જા વધુ બને છે, જે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતામાં ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે, પરંતુ આ અનિવાર્ય છે.

પ્રાઈમર સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચરની તપાસ:
પગલાં:ઓપન ઓલિગો 7 → ઇનપુટ ટેમ્પલેટ સિક્વન્સ → સબ-વિન્ડો બંધ કરો → સેવ → લોકેટ પ્રાઈમર ટેમ્પલેટ પર, પ્રાઈમર લંબાઈ સેટ કરવા માટે ctrl+D દબાવો → સેલ્ફ-ડાઈમરાઈઝેશન બોડી, હેટરોડીમર, હેરપિન, મિસમેચ વગેરે જેવા વિવિધ સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચર્સનું પૃથ્થકરણ કરો. આકૃતિ 4 ના છેલ્લા બે ચિત્રો મુખ્ય પરિણામો છે.આગળના પ્રાઈમરનું પરિણામ સારું છે, ત્યાં કોઈ સ્પષ્ટ ડિમર અને હેરપિન માળખું નથી, કોઈ સતત પૂરક પાયા નથી, અને મુક્ત ઊર્જાનું સંપૂર્ણ મૂલ્ય 4.5 કરતાં ઓછું છે, જ્યારે પાછળનું પ્રાઈમર સતત બતાવે છે 6 પાયા પૂરક છે, અને મુક્ત ઊર્જા 8.8 છે;વધુમાં, 3′ છેડે વધુ ગંભીર ડાઇમર દેખાય છે, અને સતત 4 પાયાનો ડાઇમર દેખાય છે.મુક્ત ઉર્જા વધારે ન હોવા છતાં, 3′ ડાઇમર Chl એમ્પ્લીફિકેશન વિશિષ્ટતા અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને ગંભીરપણે અસર કરી શકે છે.વધુમાં, હેરપેન્સ, હેટરોડીમર અને અસંગતતાઓ માટે તપાસ કરવી જરૂરી છે.

Fig3 oligo7 શોધ પરિણામો
એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા શોધ:
પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પીસીઆર પરિણામોને ગંભીરપણે અસર કરે છે.qRT-PCR માં પણ, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા માત્રાત્મક પરિણામો માટે ખાસ કરીને મહત્વપૂર્ણ છે.પ્રતિક્રિયા બફરમાં અન્ય પદાર્થો, મશીનો અને પ્રોટોકોલ દૂર કરો.પ્રાઈમર્સની ગુણવત્તા પણ qRT-PCR ની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પર મોટો પ્રભાવ ધરાવે છે.પરિણામોની સચોટતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે, સંબંધિત ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિફિકેશન અને સંપૂર્ણ ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિફિકેશન બંનેને પ્રાઇમર્સની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા શોધવાની જરૂર છે.તે માન્ય છે કે અસરકારક qRT-PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 85% અને 115% ની વચ્ચે છે.ત્યાં બે પદ્ધતિઓ છે:
1. માનક વળાંક પદ્ધતિ:
aસીડીએનએ મિક્સ કરો
bગ્રેડિયન્ટ મંદન
c.qPCR
ડી.એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાની ગણતરી કરવા માટે લીનિયર રીગ્રેશન સમીકરણ
2. LinRegPCR
LinRegPCR એ વાસ્તવિક સમયના RT-PCR ડેટાના વિશ્લેષણ માટેનો એક પ્રોગ્રામ છે, જેને SYBR ગ્રીન અથવા સમાન રસાયણશાસ્ત્ર પર આધારિત માત્રાત્મક PCR (qPCR) ડેટા પણ કહેવાય છે.પ્રોગ્રામ બિન-આધારરેખા સુધારેલા ડેટાનો ઉપયોગ કરે છે, દરેક નમૂના પર અલગ-અલગ બેઝલાઇન કરેક્શન કરે છે, વિન્ડો-ઓફ-રેખીયતા નક્કી કરે છે અને પછી પીસીઆર ડેટા સેટ દ્વારા સીધી રેખાને ફિટ કરવા માટે રેખીય રીગ્રેશન વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરે છે.આ રેખાના ઢોળાવ પરથી દરેક વ્યક્તિગત નમૂનાની PCR કાર્યક્ષમતા ગણવામાં આવે છે.એમ્પ્લિકન દીઠ સરેરાશ PCR કાર્યક્ષમતા અને નમૂના દીઠ Ct મૂલ્યનો ઉપયોગ પ્રતિ નમૂના દીઠ પ્રારંભિક સાંદ્રતાની ગણતરી કરવા માટે થાય છે, જે મનસ્વી ફ્લોરોસેન્સ એકમોમાં વ્યક્ત થાય છે.ડેટા ઇનપુટ અને આઉટપુટ એક્સેલ સ્પ્રેડશીટ દ્વારા છે.માત્ર નમૂના
મિશ્રણ જરૂરી છે, કોઈ ઢાળ નથી
પગલાં જરૂરી છે:(ઉદાહરણ તરીકે બોલે CFX96 લો, સ્પષ્ટ ABI સાથે તદ્દન મશીન નથી)
પ્રયોગ:તે પ્રમાણભૂત qPCR પ્રયોગ છે.
qPCR ડેટા આઉટપુટ:LinRegPCR આઉટપુટ ફાઇલોના બે સ્વરૂપોને ઓળખી શકે છે: RDML અથવા ક્વોન્ટિફિકેશન એમ્પ્લીફિકેશન પરિણામ.વાસ્તવમાં, તે મશીન દ્વારા ચક્ર નંબર અને ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલનું રીઅલ-ટાઇમ ડિટેક્શન મૂલ્ય છે અને રેખીય સેગમેન્ટ કાર્યક્ષમતાના ફ્લોરોસેન્સ ફેરફાર મૂલ્યનું વિશ્લેષણ કરીને એમ્પ્લીફિકેશન મેળવવામાં આવે છે.
ડેટા પસંદગી: સિદ્ધાંતમાં, RDML મૂલ્ય ઉપયોગી હોવું જોઈએ.એવો અંદાજ છે કે મારા કમ્પ્યુટરની સમસ્યા એ છે કે સોફ્ટવેર આરડીએમએલને ઓળખી શકતું નથી, તેથી મારી પાસે મૂળ ડેટા તરીકે એક્સેલ આઉટપુટ મૂલ્ય છે.પહેલા ડેટાનું રફ સ્ક્રિનિંગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, જેમ કે નમૂનાઓ ઉમેરવામાં નિષ્ફળતા વગેરે. આઉટપુટ ડેટામાં પોઈન્ટ ડિલીટ કરી શકાય છે (અલબત્ત, તમે તેને ડિલીટ કરી શકતા નથી, LinRegPCR પછીના તબક્કામાં આ મુદ્દાઓને અવગણશે)

Fig5 qPCR ડેટા નિકાસ

ફિગ6 ઉમેદવારના નમૂનાઓની પસંદગી

ડેટા ઇનપુટ:ઓપન ક્વોલિફિકેશન એમ્પ્લીફિકેશન results.xls, → ઓપન LinRegPCR → ફાઈલ → એક્સેલમાંથી વાંચો → આકૃતિ 7 માં બતાવ્યા પ્રમાણે પરિમાણો પસંદ કરો → ઓકે → આધારરેખા નક્કી કરો ક્લિક કરો

linRegPCR ડેટા ઇનપુટના ફિગ 7 પગલાં

પરિણામ:જો કોઈ પુનરાવર્તન ન હોય, તો કોઈ જૂથની જરૂર નથી.જો પુનરાવર્તિત થાય છે, તો નમૂના જૂથમાં જૂથીકરણને સંપાદિત કરી શકાય છે, અને જનીનનું નામ ઓળખકર્તામાં દાખલ કરવામાં આવે છે, અને પછી તે જ જનીન આપમેળે જૂથબદ્ધ થઈ જશે.છેલ્લે, ફાઇલ પર ક્લિક કરો, એક્સેલ નિકાસ કરો અને પરિણામો જુઓ.દરેક કૂવાની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને R2 પરિણામો દર્શાવવામાં આવશે.બીજું, જો તમે જૂથોમાં વહેંચો છો, તો સુધારેલ સરેરાશ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પ્રદર્શિત થશે.ખાતરી કરો કે દરેક પ્રાઈમરની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 85% અને 115% ની વચ્ચે છે.જો તે ખૂબ મોટું અથવા ખૂબ નાનું છે, તો તેનો અર્થ એ છે કે પ્રાઈમરની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા નબળી છે.

ફિગ 8 પરિણામ અને ડેટા આઉટપુટ

પ્રાયોગિક પ્રક્રિયા:
આરએનએ ગુણવત્તા જરૂરિયાતો:
શુદ્ધતા:1.72.0 સૂચવે છે કે શેષ આઇસોથિયોસાયનેટ હોઈ શકે છે.શુધ્ધ ન્યુક્લીક એસિડ A260/A230 લગભગ 2 હોવું જોઈએ .જો 230 nm પર મજબૂત શોષણ હોય, તો તે સૂચવે છે કે ફેનેટ આયનો જેવા કાર્બનિક સંયોજનો છે.વધુમાં, તે 1.5% એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા શોધી શકાય છે.માર્કરને નિર્દેશ કરો, કારણ કે ssRNA માં કોઈ વિકૃતીકરણ નથી અને પરમાણુ વજન લઘુગણકનો રેખીય સંબંધ નથી, અને પરમાણુ વજન યોગ્ય રીતે વ્યક્ત કરી શકાતું નથી.એકાગ્રતા: સૈદ્ધાંતિક રીતેનથી100ng/ul કરતાં ઓછું, જો સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો શુદ્ધતા સામાન્ય રીતે ઓછી હોય છે, ઊંચી નથી

ફિગ9 આરએનએ જેલ

વધુમાં, જો નમૂના કિંમતી હોય અને RNA સાંદ્રતા વધારે હોય, તો તેને નિષ્કર્ષણ પછી અલિક્વોટ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, અને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે RNAને 100-300ng/ul ની અંતિમ સાંદ્રતામાં પાતળું કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.માંરિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનની પ્રક્રિયા, જ્યારે mRNA ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કરવામાં આવે છે, ત્યારે ઓલિગો (dt) પ્રાઇમર્સ કે જે ખાસ કરીને પોલિએ પૂંછડીઓ સાથે જોડાઈ શકે છે તેનો ઉપયોગ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન માટે થાય છે, જ્યારે lncRNA અને circRNA કુલ RNAના રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન માટે રેન્ડમ હેક્સામર (રેન્ડમ 6 મેર) પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરે છે miRNA માટે, miRNA-વિશિષ્ટ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન માટે પ્રાઈમર્સનો ઉપયોગ થાય છે.ઘણી કંપનીઓએ હવે સ્પેશિયલ ટેલિંગ કિટ્સ લોન્ચ કરી છે.સ્ટેમ-લૂપ પદ્ધતિ માટે, ટેઇલિંગ પદ્ધતિ વધુ અનુકૂળ, ઉચ્ચ-થ્રુપુટ અને રીએજન્ટ-સેવિંગ છે, પરંતુ એક જ પરિવારના miRNA ને અલગ પાડવાની અસર સ્ટેમ-લૂપ પદ્ધતિ જેટલી સારી ન હોવી જોઈએ.પ્રત્યેક રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કીટમાં જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ (સ્ટેમ-લૂપ્સ) ની સાંદ્રતા માટેની જરૂરિયાતો હોય છે.miRNA માટે વપરાયેલ આંતરિક સંદર્ભ U6 છે.સ્ટેમ-લૂપ વ્યુત્ક્રમની પ્રક્રિયામાં, U6 ની ટ્યુબને અલગથી ઉલટાવી દેવી જોઈએ, અને U6 ના આગળના અને પાછળના પ્રાઈમર્સને સીધા જ ઉમેરવા જોઈએ.circRNA અને lncRNA બંને આંતરિક સંદર્ભ તરીકે HKG નો ઉપયોગ કરી શકે છે.માંcDNA શોધ,
જો આરએનએ સાથે કોઈ સમસ્યા નથી, તો સીડીએનએ પણ સારું હોવું જોઈએ.જો કે, જો પ્રયોગની સંપૂર્ણતા આગળ ધપાવવામાં આવે, તો આંતરિક સંદર્ભ જનીન (સંદર્ભ જનીન, RG) નો ઉપયોગ કરવો શ્રેષ્ઠ છે જે cds થી gDNA ને અલગ કરી શકે છે.સામાન્ય રીતે, આરજી એ હાઉસકીપિંગ જનીન છે., HKG) આકૃતિ 10 માં બતાવ્યા પ્રમાણે;તે સમયે, હું સોયાબીન સ્ટોરેજ પ્રોટીન બનાવતો હતો, અને આંતરિક સંદર્ભ તરીકે ઈન્ટ્રોન ધરાવતા એક્ટિન7નો ઉપયોગ કરતો હતો.gDNA માં આ પ્રાઈમરના એમ્પ્લીફાઈડ ફ્રેગમેન્ટનું કદ 452bp હતું, અને જો cDNA નો નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવે, તો તે 142bp હતો.પછી પરીક્ષણ પરિણામોમાં જાણવા મળ્યું કે સીડીએનએનો ભાગ વાસ્તવમાં જીડીએનએ દ્વારા દૂષિત હતો, અને તે પણ સાબિત થયું કે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનના પરિણામમાં કોઈ સમસ્યા નથી, અને તેનો ઉપયોગ પીસીઆર માટે નમૂના તરીકે થઈ શકે છે.એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસને સીડીએનએ સાથે સીધું ચલાવવું નકામું છે, અને તે એક પ્રસરેલું બેન્ડ છે, જે વિશ્વાસપાત્ર નથી.

ફિગ 10 cDNA શોધ

qPCR શરતોનું નિર્ધારણસામાન્ય રીતે કીટના પ્રોટોકોલ અનુસાર કોઈ સમસ્યા નથી, મુખ્યત્વે tm મૂલ્યના પગલામાં.જો કેટલાક પ્રાઇમર્સ પ્રાઇમરની ડિઝાઇન દરમિયાન સારી રીતે ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યાં નથી, જેના પરિણામે tm મૂલ્ય અને સૈદ્ધાંતિક 60°C વચ્ચે મોટો તફાવત છે, તો ભલામણ કરવામાં આવે છે કે cDNA નમૂનાઓ મિશ્રિત થયા પછી, પ્રાઇમર્સ સાથે ગ્રેડિએન્ટ PCR ચલાવો, અને TM મૂલ્ય તરીકે બેન્ડ વિના તાપમાન સેટ કરવાનું ટાળવાનો પ્રયાસ કરો.

માહિતી વિશ્લેષણ

પરંપરાગત સાપેક્ષ ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક પીસીઆર પ્રક્રિયા પદ્ધતિ મૂળભૂત રીતે 2 મુજબ છે-ΔΔCT.ડેટા પ્રોસેસિંગ ટેમ્પલેટ.

સંબંધિત વસ્તુઓ:

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર સરળ^TM -તકમાન

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર સરળ^TM -SYBR ગ્રીન આઇ

RT Easy I (પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ cDNA સંશ્લેષણ માટે માસ્ટર પ્રિમિક્સ)

RT Easy II (qPCR માટે પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ cDNA સંશ્લેષણ માટે માસ્ટર પ્રિમિક્સ)