પ્રયોગશાળામાં નવા તરીકે, ઓછા રૂપાંતરણ દર સાથે છોડના સમૂહમાંથી સકારાત્મક છોડની તપાસ કરવી એ સારું કામ નથી.સૌપ્રથમ, ડીએનએ એક પછી એક મોટી સંખ્યામાં નમૂનાઓમાંથી કાઢવામાં આવશે, અને પછી વિદેશી જનીનો પીસીઆર દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવશે.જો કે, પરિણામો ઘણીવાર ખાલી અને કેટલીક વસ્તુઓ સાથે બેન્ડ હોય છે, પરંતુ તે નક્કી કરવું અશક્ય છે કે શું ચૂકી ગયેલી શોધ છે કે ખોટી તપાસ છે..શું આવી પ્રાયોગિક પ્રક્રિયા અને પરિણામોનો સામનો કરવો ખૂબ જ લાચાર છે?ચિંતા કરશો નહીં, ભાઈ તમને શીખવે છે કે કેવી રીતે ટ્રાન્સજેનિક પોઝીટીવ છોડને સરળતાથી અને સચોટ રીતે તપાસી શકાય.

પગલું 1

ડિઝાઇન ડિટેક્શન પ્રાઇમર્સ

ચકાસવા માટેના નમૂના અનુસાર અંતર્જાત જનીન અને એક્ઝોજેનસ જનીન શોધી કાઢો અને પ્રાઈમર ડિઝાઇન માટે જનીનમાં પ્રતિનિધિ 100-500bp ક્રમ પસંદ કરો.સારા પ્રાઇમર્સ શોધ પરિણામોની ચોકસાઈની ખાતરી કરી શકે છે અને તપાસનો સમય ટૂંકો કરી શકે છે (સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા ડિટેક્શન પ્રાઇમર્સ માટે પરિશિષ્ટ જુઓ).

સૂચના:નવા ડિઝાઇન કરાયેલ પ્રાઇમર્સને પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવાની જરૂર છે અને મોટા પાયે શોધ કરતા પહેલા શોધની ચોકસાઈ, ચોકસાઇ અને શોધ મર્યાદાને ચકાસવાની જરૂર છે.

પગલું 2

પ્રાયોગિક પ્રોટોકોલ ડિઝાઇન કરો

સકારાત્મક નિયંત્રણ: PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી અને સ્થિતિ સામાન્ય છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે ટેમ્પલેટ તરીકે લક્ષ્ય ટુકડો ધરાવતા શુદ્ધ ડીએનએનો ઉપયોગ કરો.

નકારાત્મક/ખાલી નિયંત્રણ: PCR સિસ્ટમમાં દૂષિતતાનો સ્ત્રોત છે કે કેમ તે શોધવા માટે DNA ટેમ્પલેટ અથવા ddH2O નો ઉપયોગ કરો જેમાં ટેમ્પલેટ તરીકે લક્ષ્ય ટુકડો ન હોય.

આંતરિક સંદર્ભ નિયંત્રણ: પીસીઆર દ્વારા નમૂના શોધી શકાય છે કે કેમ તે મૂલ્યાંકન કરવા માટે પરીક્ષણ કરવા માટે નમૂનાના અંતર્જાત જનીનના પ્રાઈમર/પ્રોબ સંયોજનનો ઉપયોગ કરો.

સૂચના:

પ્રાયોગિક પરિણામોની માન્યતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે દરેક પરીક્ષણ માટે હકારાત્મક, નકારાત્મક/ખાલી નિયંત્રણો અને આંતરિક નિયંત્રણ નિયંત્રણો સેટ કરવા જોઈએ.

પ્રયોગની તૈયારી

ઉપયોગ કરતા પહેલા, અવલોકન કરો કે શું સોલ્યુશન સમાનરૂપે મિશ્રિત છે.જો વરસાદ જોવા મળે છે, તો તેને ઉપયોગ કરતા પહેલા સૂચનો અનુસાર વિસર્જન અને મિશ્રિત કરવાની જરૂર છે.અસમાન આયન વિતરણ ટાળવા માટે ઉપયોગ કરતા પહેલા 2×PCR મિશ્રણને માઇક્રોપીપેટ સાથે વારંવાર પાઈપેટ અને મિશ્રિત કરવાની જરૂર છે.

સૂચના:

મેન્યુઅલ બહાર કાઢો અને તેને ધ્યાનથી વાંચો, અને મેન્યુઅલની જરૂરિયાતો અનુસાર સખત રીતે પ્રયોગ પહેલાં તૈયારી કરો.

પગલું 4

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ તૈયાર કરો

પ્રાયોગિક પ્રોટોકોલ મુજબ, પ્રાઇમર્સ, H2O અને 2×PCR મિશ્રણને સરખે ભાગે ભેળવી, સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો અને દરેક પ્રતિક્રિયા ટ્યુબમાં વિતરિત કરો.

સૂચના:

મોટા પાયે અથવા લાંબા ગાળાના પરીક્ષણ માટે, UNG એન્ઝાઇમ ધરાવતી PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, જે PCR ઉત્પાદનોને કારણે થતા એરોસોલ દૂષણને અસરકારક રીતે ટાળી શકે છે.

પગલું 5

પ્રતિક્રિયા નમૂના ઉમેરો

ડાયરેક્ટ પીસીઆર ટેક્નોલોજીનો ઉપયોગ કરીને, કંટાળાજનક ન્યુક્લીક એસિડ શુદ્ધિકરણ પ્રક્રિયાની જરૂર નથી, નમૂનાનો નમૂનો 10 મિનિટની અંદર તૈયાર કરી શકાય છે, અને અનુરૂપ PCR પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ ઉમેરી શકાય છે.

સૂચના:

ક્લીવેજ પદ્ધતિમાં વધુ સારી શોધ અસર હોય છે, અને પ્રાપ્ત ઉત્પાદનનો ઉપયોગ બહુવિધ શોધ પ્રતિક્રિયાઓ માટે થઈ શકે છે.

5.1: પાંદડાઓનો સીધો વિસ્તરણ

મેન્યુઅલમાં ચિત્રની સાઈઝ મુજબ, 2-3 મીમીના વ્યાસવાળા પાંદડાની પેશીને કાપીને પીસીઆર પ્રતિક્રિયા પદ્ધતિમાં મૂકો.

નોંધ: ખાતરી કરો કે પાંદડાના ટુકડાઓ પીસીઆર પ્રતિક્રિયા દ્રાવણમાં સંપૂર્ણપણે ડૂબી ગયા છે, અને વધુ પડતા પાંદડાની પેશી ઉમેરશો નહીં.

5.2: લીફ સ્પ્લિટ પદ્ધતિ

પાંદડાની પેશીને 5-7 મીમીના વ્યાસ સાથે કાપો અને તેને સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં મૂકો.જો તમે પરિપક્વ પાંદડા પસંદ કરો છો, તો કૃપા કરીને પાંદડાની મુખ્ય નસની પેશીઓનો ઉપયોગ કરવાનું ટાળો.પીપેટ 50ul બફર P1 lysate ને સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં તેની ખાતરી કરવા માટે કે lysate સંપૂર્ણપણે પાંદડાની પેશીઓને નિમજ્જન કરી શકે છે, તેને થર્મલ સાયકલ અથવા મેટલ બાથમાં મૂકી શકે છે અને 5-10 મિનિટ માટે 95°C પર લિસેટ કરી શકે છે.

50ul બફર P2 ન્યુટ્રલાઇઝેશન સોલ્યુશન ઉમેરો અને સારી રીતે ભળી દો.પરિણામી lysate એક નમૂના તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે અને PCR પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમમાં ઉમેરી શકાય છે.

નોંધ: નમૂનાનો જથ્થો PCR સિસ્ટમના 5-10% ની વચ્ચે છે, અને તે 20% થી વધુ ન હોવો જોઈએ (ઉદાહરણ તરીકે, 20μl PCR સિસ્ટમમાં, 1-2μl લિસિસ સોલ્યુશન ઉમેરો, 4μl કરતાં વધુ નહીં).

પગલું 6

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા ટ્યુબને સેન્ટ્રીફ્યુજીંગ કર્યા પછી, તેને એમ્પ્લીફિકેશન માટે પીસીઆર સાધનમાં મૂકવામાં આવે છે.

સૂચના:

પ્રતિક્રિયા એમ્પ્લીફિકેશન માટે બિન-શુદ્ધ નમૂનાનો ઉપયોગ કરે છે, તેથી એમ્પ્લીફિકેશન ચક્રની સંખ્યા શુદ્ધ ડીએનએ ટેમ્પલેટનો ઉપયોગ કરતા 5-10 વધુ ચક્ર છે.

પગલું 7

ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ શોધ અને પરિણામ વિશ્લેષણ

M: 100bp DNA લેડર

1\4: શુદ્ધ DNA પદ્ધતિ

2\5: ડાયરેક્ટ PCR પદ્ધતિ

3\6: ખાલી નિયંત્રણ

QC:

પ્રયોગમાં સેટ કરેલ વિવિધ નિયંત્રણોના પરીક્ષણ પરિણામો નીચેની શરતોને પૂર્ણ કરવા જોઈએ.નહિંતર, સમસ્યાના કારણનું વિશ્લેષણ કરવું જોઈએ, અને સમસ્યા દૂર થયા પછી ફરીથી પરીક્ષણ કરવું જોઈએ.

કોષ્ટક 1. વિવિધ નિયંત્રણ જૂથોના સામાન્ય પરીક્ષણ પરિણામો

*જ્યારે પ્લાઝમિડનો ઉપયોગ હકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે થાય છે, ત્યારે અંતર્જાત જનીન પરીક્ષણ પરિણામ નકારાત્મક હોઈ શકે છે

પરિણામ ચુકાદો:

A. નમૂનાના અંતર્જાત જનીનનું પરીક્ષણ પરિણામ નકારાત્મક છે, જે દર્શાવે છે કે સામાન્ય પીસીઆર શોધ માટે યોગ્ય ડીએનએ નમૂનામાંથી કાઢી શકાતું નથી અથવા કાઢવામાં આવેલા ડીએનએમાં પીસીઆર પ્રતિક્રિયા અવરોધકો હોય છે, અને ડીએનએ ફરીથી કાઢવા જોઈએ.

B. નમૂનાના અંતર્જાત જનીનનું પરીક્ષણ પરિણામ સકારાત્મક છે, અને એક્ઝોજેનસ જનીનનું પરીક્ષણ પરિણામ નકારાત્મક છે, જે દર્શાવે છે કે સામાન્ય PCR શોધ માટે યોગ્ય ડીએનએ નમૂનામાંથી કાઢવામાં આવે છે, અને તે નક્કી કરી શકાય છે કે નમૂનામાં XXX જનીન શોધાયેલ નથી.

C. નમૂનાના અંતર્જાત જનીનનું પરીક્ષણ પરિણામ સકારાત્મક છે, અને એક્ઝોજેનસ જનીનનું પરીક્ષણ પરિણામ હકારાત્મક છે, જે દર્શાવે છે કે સામાન્ય PCR શોધ માટે યોગ્ય DNA નમૂનામાંથી કાઢવામાં આવ્યું છે, અને નમૂના DNAમાં XXX જનીન છે.પુષ્ટિકરણ પ્રયોગો આગળ કરી શકાય છે.

પગલું 8

ડિઝાઇન ડિટેક્શન પ્રાઇમર્સ

પ્રયોગ પછી, પર્યાવરણીય પ્રદૂષણને રોકવા માટે પ્રાયોગિક વિસ્તારને સાફ કરવા માટે 2% સોડિયમ હાઇપોક્લોરાઇટ સોલ્યુશન અને 70% ઇથેનોલ સોલ્યુશનનો ઉપયોગ કરો.