一, પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની સંવેદનશીલતામાં વધારો:

1. ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા આરએનએને અલગ કરો:

સફળ cDNA સંશ્લેષણ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા RNA માંથી આવે છે.ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળી આરએનએ ઓછામાં ઓછી પૂર્ણ-લંબાઈની હોવી જોઈએ અને EDTA અથવા SDS જેવા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અવરોધકોથી મુક્ત હોવી જોઈએ.RNA ની ગુણવત્તા નક્કી કરે છે કે તમે cDNA માં કેટલી ક્રમની માહિતીનું અનુલેખન કરી શકો છો.સામાન્ય RNA શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ એ ગ્વાનિડિન આઇસોથિયોસાયનેટ/એસિડ ફિનોલનો ઉપયોગ કરીને એક-પગલાની પદ્ધતિ છે.RNase ના ટ્રેસ જથ્થા દ્વારા દૂષણને રોકવા માટે, RNase-સમૃદ્ધ નમૂનાઓ (જેમ કે સ્વાદુપિંડ) માંથી અલગ કરાયેલ RNA ને ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા RNA જાળવવા માટે, ખાસ કરીને લાંબા ગાળાના સંગ્રહ માટે ફોર્મલ્ડીહાઈડમાં સંગ્રહિત કરવાની જરૂર છે.ઉંદરના યકૃતમાંથી કાઢવામાં આવેલ આરએનએ મૂળભૂત રીતે એક સપ્તાહ સુધી પાણીમાં સંગ્રહ કર્યા પછી અધોગતિ પામ્યું હતું, જ્યારે ઉંદરની બરોળમાંથી કાઢવામાં આવેલ આરએનએ 3 વર્ષ સુધી પાણીમાં સંગ્રહ કર્યા પછી સ્થિર રહે છે.વધુમાં, 4 kb કરતાં વધુ લાંબી ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ નાની ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ્સ કરતાં ટ્રેસ RNase દ્વારા અધોગતિ પ્રત્યે વધુ સંવેદનશીલ હોય છે.સંગ્રહિત આરએનએ નમૂનાઓની સ્થિરતા વધારવા માટે, આરએનએને ડીયોનાઇઝ્ડ ફોર્મામાઇડમાં ઓગાળી શકાય છે અને -70 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે.આરએનએને જાળવવા માટે વપરાતું ફોર્મમાઇડ આરએનએ-ડિગ્રેજિંગ કચરોથી મુક્ત હોવું જોઈએ.સ્વાદુપિંડમાંથી આરએનએ ફોર્મમાઇડમાં ઓછામાં ઓછા એક વર્ષ સુધી સાચવી શકાય છે.RNA નો ઉપયોગ કરવાની તૈયારી કરતી વખતે, તમે નીચેની પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરી શકો છો RNA ને અવક્ષેપિત કરવા માટે: NaCl ને 0.2M અને ઇથેનોલના 4 ગણા વોલ્યુમમાં ઉમેરો, 3-5 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને મૂકો, અને 5 મિનિટ માટે 10,000×g પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.

2. RNaseH-નિષ્ક્રિય (RNaseH-) રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરો:

સીડીએનએ સંશ્લેષણની લંબાઈ અને ઉપજ વધારવા માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયાઓમાં RNase અવરોધકો ઘણીવાર ઉમેરવામાં આવે છે.બફર અને રિડ્યુસિંગ એજન્ટ (જેમ કે ડીટીટી) ની હાજરીમાં ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ સિન્થેસિસ રિએક્શન દરમિયાન RNase ઇન્હિબિટર ઉમેરવું જોઈએ, કારણ કે cDNA સિન્થેસિસ પહેલાંની પ્રક્રિયા અવરોધકને ડિનેચર કરે છે, જેનાથી RNA ને ડિગ્રેજ કરી શકે તેવા બાઉન્ડ RNase મુક્ત કરે છે.પ્રોટીન RNase અવરોધકો માત્ર RNase A, B, C દ્વારા RNA ના અધોગતિને અટકાવે છે અને ત્વચા પર RNase અટકાવતા નથી, તેથી આ અવરોધકોનો ઉપયોગ કરવા છતાં તમારી આંગળીઓમાંથી RNase દાખલ ન થાય તેની કાળજી રાખો.

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ આરએનએના સીડીએનએમાં રૂપાંતરણને ઉત્પ્રેરિત કરે છે.એમ-એમએલવી અને એએમવી બંને તેમની પોતાની પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ ઉપરાંત અંતર્જાત RNaseH પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.RNaseH પ્રવૃત્તિ અને પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ RNA ટેમ્પ્લેટ અને DNA પ્રાઈમર અથવા cDNA એક્સ્ટેંશન સ્ટ્રૅન્ડ વચ્ચે રચાયેલા હાઇબ્રિડ સ્ટ્રૅન્ડ માટે એકબીજા સાથે સ્પર્ધા કરે છે અને RNA:DNA સંકુલમાં RNA સ્ટ્રૅન્ડને ડિગ્રેજ કરે છે.RNaseH પ્રવૃત્તિ દ્વારા અધોગતિ પામેલ RNA ટેમ્પલેટ હવે cDNA સંશ્લેષણ માટે અસરકારક સબસ્ટ્રેટ તરીકે સેવા આપી શકશે નહીં, જે cDNA સંશ્લેષણની ઉપજ અને લંબાઈ ઘટાડે છે.તેથી, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝની RNaseH પ્રવૃત્તિને દૂર કરવી અથવા તેને મોટા પ્રમાણમાં ઘટાડવાનું ફાયદાકારક રહેશે..

સુપરસ્ક્રીપ્ટ Ⅱ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ, RNaseH- MMLV રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને થર્મોસ્ક્રિપ્ટ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, RNaseH- AMV, MMLV અને AMV કરતાં વધુ રકમ અને વધુ પૂર્ણ-લંબાઈના cDNA મેળવી શકે છે.RT-PCR સંવેદનશીલતા cDNA સંશ્લેષણની માત્રાથી પ્રભાવિત થશે.થર્મોસ્ક્રિપ્ટ એએમવી કરતા વધુ સંવેદનશીલ છે.RT-PCR ઉત્પાદનોનું કદ સીડીએનએનું સંશ્લેષણ કરવા માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજની ક્ષમતા દ્વારા મર્યાદિત છે, ખાસ કરીને જ્યારે મોટા સીડીએનએનું ક્લોનિંગ કરવામાં આવે છે.MMLV ની સરખામણીમાં, SuperScripⅡ એ લાંબા RT-PCR ઉત્પાદનોની ઉપજમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો છે.RNaseH-રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસે પણ થર્મોસ્ટેબિલિટીમાં વધારો કર્યો છે, તેથી પ્રતિક્રિયા સામાન્ય 37-42°C કરતા વધુ તાપમાને કરી શકાય છે.સૂચવેલ સંશ્લેષણ શરતો હેઠળ, oligo(dT) પ્રાઈમર અને [α-P]dCTP ના 10 μCi નો ઉપયોગ કરો.પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડની કુલ ઉપજની ગણતરી TCA વરસાદ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.પૂર્ણ-લંબાઈના સીડીએનએનું વિશ્લેષણ કદ-સૉર્ટ કરેલા બેન્ડ્સનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું અને આલ્કલાઇન એગેરોઝ જેલ પર ગણવામાં આવ્યું હતું.

3. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે ઇન્ક્યુબેશન તાપમાન વધારવું：

ઉચ્ચ ઇન્ક્યુબેશન તાપમાન આરએનએ ગૌણ માળખું ખોલવામાં મદદ કરે છે, પ્રતિક્રિયાની ઉપજમાં વધારો કરે છે.મોટાભાગના આરએનએ ટેમ્પલેટો માટે, આરએનએ અને પ્રાઇમર્સને બફર અથવા મીઠા વિના 65°C પર ઉકાળવાથી, ત્યારબાદ બરફ પર ઝડપી ઠંડક મોટાભાગની ગૌણ રચનાઓને દૂર કરશે અને પ્રાઇમર્સને બાંધવા દેશે.જો કે, કેટલાક ટેમ્પલેટ્સમાં ગરમીના વિકૃતિકરણ પછી પણ ગૌણ બંધારણો હોય છે.આ મુશ્કેલ નમૂનાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન થર્મોસ્ક્રિપ્ટ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરીને અને એમ્પ્લીફિકેશનને સુધારવા માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયાને ઊંચા તાપમાને મૂકીને કરી શકાય છે.ઉચ્ચ ઇન્ક્યુબેશન તાપમાન પણ વિશિષ્ટતામાં વધારો કરી શકે છે, ખાસ કરીને જ્યારે સીડીએનએ સંશ્લેષણ માટે જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ (જીએસપી) નો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે (જુઓ પ્રકરણ 3).જો GSP નો ઉપયોગ કરી રહ્યા હોવ, તો ખાતરી કરો કે પ્રાઇમર્સનું Tm અપેક્ષિત ઉષ્ણતામાન જેટલું જ છે.ઓલિગો(dT) અને 60°C થી ઉપરના રેન્ડમ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરશો નહીં.રેન્ડમ પ્રાઈમર્સને 60 ° સે સુધી વધતા પહેલા 10 મિનિટ માટે 25°C પર ઉકાળવાની જરૂર પડે છે.ઉચ્ચ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન તાપમાનનો ઉપયોગ કરવા ઉપરાંત, RNA/પ્રાઈમર મિશ્રણને 65°C ડિનેચ્યુરેશન તાપમાનથી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન ઇન્ક્યુબેશન તાપમાનમાં સીધા સ્થાનાંતરિત કરીને અને પ્રી-વોર્મ્ડ 2× રિએક્શન મિશ્રણ (cDNA હોટ-સ્ટાર્ટ સિન્થેસિસ) ઉમેરીને વિશિષ્ટતા પણ સુધારી શકાય છે.આ અભિગમ ઇન્ટરમોલેક્યુલર બેઝ પેરિંગને રોકવામાં મદદ કરે છે જે નીચા તાપમાને થાય છે.RT-PCR માટે જરૂરી બહુવિધ તાપમાન સ્વિચિંગને થર્મલ સાયકલનો ઉપયોગ કરીને સરળ બનાવી શકાય છે.

Tth થર્મોસ્ટેબલ પોલિમરેઝ Mg2+ની હાજરીમાં DNA પોલિમરેઝ તરીકે અને Mn2+ની હાજરીમાં RNA પોલિમરેઝ તરીકે કામ કરે છે.તેને મહત્તમ 65 ડિગ્રી સેલ્સિયસ તાપમાને ગરમ રાખી શકાય છે.જો કે, PCR દરમિયાન Mn2+ ની હાજરી વફાદારી ઘટાડે છે, જે Tth પોલિમરેઝને ઉચ્ચ-ચોકસાઇવાળા એમ્પ્લીફિકેશન માટે ઓછા યોગ્ય બનાવે છે, જેમ કે cDNA નું ક્લોનિંગ.વધુમાં, Tth ની ઓછી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા છે, જે સંવેદનશીલતા ઘટાડે છે, અને, કારણ કે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને PCR એક જ એન્ઝાઇમ સાથે કરી શકાય છે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન વિના નિયંત્રણ પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ દૂષિત જીનોમિક DNA સાથે cDNA એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોની તુલના કરવા માટે કરી શકાતો નથી.એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટ્સને અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.

4. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનને પ્રોત્સાહન આપતા ઉમેરણો:

ગ્લિસરોલ અને ડીએમએસઓ સહિતના ઉમેરણો ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ સિન્થેસિસ રિએક્શનમાં ઉમેરવામાં આવે છે, જે ન્યુક્લિયક એસિડ ડબલ-સ્ટ્રૅન્ડની સ્થિરતા ઘટાડી શકે છે અને RNA ની ગૌણ રચનાને બંધ કરી શકે છે.સુપરસ્ક્રીપ્ટ II અથવા MMLV પ્રવૃત્તિને અસર કર્યા વિના 20% ગ્લિસરોલ અથવા 10% DMSO સુધી ઉમેરી શકાય છે.AMV પ્રવૃત્તિ ગુમાવ્યા વિના 20% ગ્લિસરોલ સુધી પણ સહન કરી શકે છે.SuperScriptⅡ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શનમાં RT-PCR ની સંવેદનશીલતા વધારવા માટે, 10% ગ્લિસરોલ ઉમેરી શકાય છે અને 45 °C તાપમાને ઉકાળી શકાય છે.જો રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શન પ્રોડક્ટનો 1/10 પીસીઆરમાં ઉમેરવામાં આવે છે, તો એમ્પ્લીફિકેશન રિએક્શનમાં ગ્લિસરોલની સાંદ્રતા 0.4% છે, જે પીસીઆરને રોકવા માટે પૂરતી નથી.

5. RNaseH સારવાર:

PCR પહેલા RNaseH સાથે cDNA સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયાઓની સારવાર સંવેદનશીલતામાં વધારો કરી શકે છે.કેટલાક નમૂનાઓ માટે, એવું માનવામાં આવે છે કે સીડીએનએ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયામાં આરએનએ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોના બંધનને અટકાવે છે, આ કિસ્સામાં RNaseH સારવાર સંવેદનશીલતામાં વધારો કરી શકે છે.સામાન્ય રીતે, RNaseH સારવાર જરૂરી છે જ્યારે લાંબા સમય સુધી પૂર્ણ-લંબાઈના cDNA ટાર્ગેટ ટેમ્પ્લેટ્સ, જેમ કે લો-કોપી ટ્યુબરસ સ્કેરોસિસ II એમ્પ્લીફાય કરવામાં આવે છે.આ મુશ્કેલ નમૂના માટે, RNaseH સારવારએ સુપરસ્ક્રિપ્ટ II અથવા AMV-સંશ્લેષિત cDNA દ્વારા ઉત્પાદિત સિગ્નલને વધારેલ.મોટાભાગની RT-PCR પ્રતિક્રિયાઓ માટે, RNaseH સારવાર વૈકલ્પિક છે, કારણ કે 95°C પર પીસીઆર ડિનેચ્યુરેશન સ્ટેપ સામાન્ય રીતે RNA:DNA કોમ્પ્લેક્સમાં RNAને હાઇડ્રોલાઇઝ કરે છે.

6. નાની આરએનએ શોધ પદ્ધતિમાં સુધારો:

RT-PCR એ ખાસ કરીને પડકારજનક છે જ્યારે માત્ર થોડી માત્રામાં RNA ઉપલબ્ધ હોય.RNA અલગતા દરમિયાન વાહક તરીકે ઉમેરવામાં આવેલ ગ્લાયકોજેન નાના નમૂનાઓની ઉપજ વધારવામાં મદદ કરે છે.ટ્રિઝોલ ઉમેરવાની સાથે જ RNase-મુક્ત ગ્લાયકોજેન ઉમેરી શકાય છે.ગ્લાયકોજેન પાણીમાં દ્રાવ્ય છે અને તેને પછીના વરસાદમાં મદદ કરવા માટે આરએનએ સાથે જલીય તબક્કામાં રાખી શકાય છે.50 મિલિગ્રામ પેશી અથવા 106 સંવર્ધિત કોષો કરતાં ઓછા નમૂનાઓ માટે, RNase-મુક્ત ગ્લાયકોજેનની ભલામણ કરેલ સાંદ્રતા 250 μg/ml છે.

સુપરસ્ક્રિપ્ટ II નો ઉપયોગ કરીને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન રિએક્શનમાં એસિટિલેટેડ BSA ઉમેરવાથી સંવેદનશીલતા વધી શકે છે, અને RNA ની નાની માત્રા માટે, સુપરસ્ક્રીપ્ટ II ની માત્રામાં ઘટાડો અને RNaseOut ન્યુક્લિઝ ઇન્હિબિટરના 40 એકમો ઉમેરવાથી તપાસના સ્તરમાં વધારો થઈ શકે છે.જો RNA આઇસોલેશન પ્રક્રિયામાં ગ્લાયકોજેનનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો પણ વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયા માટે સુપરસ્ક્રીપ્ટ II નો ઉપયોગ કરતી વખતે BSA અથવા RNase અવરોધક ઉમેરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

二, RT-PCR વિશિષ્ટતા વધારો

1. CND એસિન્થેસિસ:

ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ સીડીએનએ સંશ્લેષણ ત્રણ અલગ અલગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને શરૂ કરી શકાય છે, જેની સંબંધિત વિશિષ્ટતા સીડીએનએ સંશ્લેષણની માત્રા અને પ્રકારને અસર કરે છે.

રેન્ડમ પ્રાઈમર પદ્ધતિ એ ત્રણ પદ્ધતિઓમાંથી ઓછામાં ઓછી વિશિષ્ટ હતી.પ્રાઈમર્સ સમગ્ર ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ દરમિયાન બહુવિધ સાઇટ્સ પર એનિલ કરે છે, જે ટૂંકા, આંશિક-લંબાઈના cDNA પેદા કરે છે.આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ વારંવાર 5′ અંતિમ સિક્વન્સ મેળવવા અને RNA ટેમ્પ્લેટ્સમાંથી ગૌણ માળખાના વિસ્તારો સાથે અથવા સમાપ્તિ સાઇટ્સ સાથે સીડીએનએ મેળવવા માટે થાય છે જે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ દ્વારા નકલ કરી શકાતી નથી.સૌથી લાંબો સીડીએનએ મેળવવા માટે, દરેક આરએનએ નમૂનામાં પ્રાઇમર્સ અને આરએનએનો ગુણોત્તર પ્રયોગમૂલક રીતે નક્કી કરવો જરૂરી છે.રેન્ડમ પ્રાઈમર્સની શરૂઆતની સાંદ્રતા 50 થી 250 ng પ્રતિ 20 μl પ્રતિક્રિયામાં હતી.રેન્ડમ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને કુલ આરએનએમાંથી સંશ્લેષિત સીડીએનએ મુખ્યત્વે રિબોસોમલ આરએનએ હોવાથી, સામાન્ય રીતે પોલી(એ)+આરએનએ નમૂના તરીકે પસંદ કરવામાં આવે છે.

ઓલિગો(ડીટી) પ્રાઇમર્સ રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ કરતાં વધુ ચોક્કસ છે.તે મોટાભાગના યુકેરીયોટિક mRNAs ના 3′ છેડે જોવા મળતી પોલી(A) પૂંછડીમાં સંકર કરે છે.પોલી(એ)+ આરએનએ કુલ આરએનએના આશરે 1% થી 2% હોવાને કારણે, સીડીએનએની માત્રા અને જટિલતા રેન્ડમ પ્રાઈમર કરતાં ઘણી ઓછી છે.તેની ઉચ્ચ વિશિષ્ટતાને કારણે, ઓલિગો(ડીટી) ને સામાન્ય રીતે પ્રાઇમર્સ અને પોલી(એ)+ પસંદગીના આરએનએના ગુણોત્તરના ઑપ્ટિમાઇઝેશનની જરૂર હોતી નથી.0.5μg oligo(dT) પ્રતિ 20μl પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.oligo(dT)12-18 મોટાભાગના RT-PCR માટે યોગ્ય છે.ThermoScript RT-PCR સિસ્ટમ oligo(dT)20 ઓફર કરે છે કારણ કે ઉચ્ચ ઇન્ક્યુબેશન તાપમાન માટે તેની વધુ સારી થર્મલ સ્થિરતા છે.

જીન સ્પેસિફિક પ્રાઇમર્સ (GSP) એ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન સ્ટેપ માટે સૌથી ચોક્કસ પ્રાઇમર્સ છે.જીએસપી એ એન્ટિસેન્સ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ છે જે ખાસ કરીને આરએનએ લક્ષ્ય ક્રમમાં હાઇબ્રિડાઇઝ કરી શકે છે, રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ અથવા ઓલિગો(ડીટી)થી વિપરીત, જે તમામ આરએનએ સાથે જોડાણ કરે છે.PCR પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સમાન નિયમો રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયાઓમાં GSP ની ડિઝાઇન પર લાગુ થાય છે.જીએસપી એ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઈમર જેવો જ ક્રમ હોઈ શકે છે જે એમઆરએનએના 3′-સૌથી વધુ છેડાને જોડે છે, અથવા જીએસપી રિવર્સ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઈમરના ડાઉનસ્ટ્રીમને એનલ કરવા માટે ડિઝાઇન કરી શકાય છે.કેટલાક વિસ્તૃત વિષયો માટે, સફળ RT-PCR માટે એક કરતાં વધુ એન્ટિસેન્સ પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે કારણ કે લક્ષ્ય આરએનએનું ગૌણ માળખું પ્રાઈમર બંધનને અટકાવી શકે છે.20 μl ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ સિન્થેસિસ રિએક્શનમાં 1 pmol antisense GSP નો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

2. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે ઇન્ક્યુબેશન તાપમાન વધારવું：

GSP વિશિષ્ટતાના સંપૂર્ણ લાભનો સંપૂર્ણ લાભ લેવા માટે, ઉચ્ચ થર્મોસ્ટેબિલિટી સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરવો જોઈએ.થર્મોસ્ટેબલ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસને પ્રતિક્રિયાની કડકતા વધારવા માટે ઊંચા તાપમાને ઉકાળી શકાય છે.દાખલા તરીકે, જો GSP 55°C પર બંધ થાય છે, તો GSPની વિશિષ્ટતાનો સંપૂર્ણ ઉપયોગ કરવામાં આવશે નહીં જો AMV અથવા M-MLV નો ઉપયોગ 37°Cની નીચી કડકતા પર રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે કરવામાં આવે.જો કે, સુપરસ્ક્રીપ્ટ II અને થર્મોસ્ક્રિપ્ટને 50°C અથવા તેથી વધુ તાપમાને પ્રતિક્રિયા આપી શકાય છે, જે નીચા તાપમાને પેદા થતા બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોને દૂર કરશે.મહત્તમ વિશિષ્ટતા માટે, આરએનએ/પ્રાઈમર મિશ્રણને 65°C ડિનેચ્યુરેશન તાપમાનથી સીધા જ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન ઇન્ક્યુબેશન તાપમાનમાં સ્થાનાંતરિત કરી શકાય છે અને તેને પ્રી-વોર્મ્ડ 2× રિએક્શન મિક્સ (cDNA સિન્થેસિસ હોટ સ્ટાર્ટ)માં ઉમેરી શકાય છે.આ નીચા તાપમાને ઇન્ટરમોલેક્યુલર બેઝ પેરિંગને રોકવામાં મદદ કરે છે.RT-PCR માટે જરૂરી બહુવિધ તાપમાન સંક્રમણોને થર્મલ સાયકલરનો ઉપયોગ કરીને સરળ બનાવી શકાય છે.

3. જીનોમિક ડીએનએ દૂષણ ઘટાડે છે:

આરટી-પીસીઆરમાં સંભવિત મુશ્કેલી એ આરએનએમાં જીનોમિક ડીએનએનું દૂષણ છે.સારી આરએનએ આઇસોલેશન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવો, જેમ કે ટ્રિઝોલ રીએજન્ટ, આરએનએ તૈયારીને દૂષિત કરતા જીનોમિક ડીએનએની માત્રામાં ઘટાડો કરશે.જીનોમિક ડીએનએમાંથી મેળવેલા ઉત્પાદનોને ટાળવા માટે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પહેલા દૂષિત ડીએનએને દૂર કરવા માટે આરએનએને એમ્પ્લીફિકેશન-ગ્રેડ ડીએનએઝ I સાથે સારવાર કરી શકાય છે.DNase I પાચન 65°C પર 10 મિનિટ માટે 2.0 mM EDTA માં સેમ્પલ ઇન્ક્યુબેટ કરીને સમાપ્ત કરવામાં આવ્યું હતું.EDTA મેગ્નેશિયમ આયનોને ચીલેટ કરી શકે છે, ઊંચા તાપમાને મેગ્નેશિયમ આયન આધારિત આરએનએ હાઇડ્રોલિસિસને અટકાવે છે.

જિનોમિક ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોને દૂષિત કરતા એમ્પ્લીફાઇડ સીડીએનએને અલગ કરવા માટે, પ્રાઇમર્સ એવી ડિઝાઇન કરી શકાય છે કે દરેક એનિલ એક્સોન્સને અલગ કરે.સીડીએનએમાંથી મેળવેલા પીસીઆર ઉત્પાદનો દૂષિત જીનોમિક ડીએનએમાંથી મેળવેલા ઉત્પાદનો કરતાં ટૂંકા હશે.વધુમાં, આપેલ ટુકડો જીનોમિક ડીએનએ અથવા સીડીએનએમાંથી લેવામાં આવ્યો છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે દરેક આરએનએ ટેમ્પ્લેટ પર રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન વિના નિયંત્રણ પ્રયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન વિના મેળવેલ પીસીઆર પ્રોડક્ટ જીનોમમાંથી લેવામાં આવે છે.