Ⅰ. પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની સંવેદનશીલતામાં વધારો:
1. અલગ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા RNA:
સફળ સીડીએનએ સંશ્લેષણ ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા આરએનએમાંથી આવે છે.ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા RNA એ ઓછામાં ઓછા કુલ લાંબા સમય સુધી સુનિશ્ચિત કરવું જોઈએ અને તેમાં અવરોધકો શામેલ નથી કે જેમાં રેકોર્ડિંગ એન્ઝાઇમ ન હોય, જેમ કે EDTA અથવા SDS.RNA ની ગુણવત્તા એ ક્રમની માહિતીનું મહત્તમ મૂલ્ય નક્કી કરે છે જે તમે cDNA માં ટ્રાન્સક્રાઇબ કરી શકો છો.સામાન્ય આરએનએ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ એ આઇસોસાયનેટ/એસિડોફેનોલનો ઉપયોગ કરવાની એક પગલું પદ્ધતિ છે.RNase ના પ્રદૂષણને રોકવા માટે, RNase (જેમ કે સ્વાદુપિંડ) માં સમૃદ્ધ નમૂનામાંથી અલગ પડેલા RNA ને ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા RNAને બચાવવા માટે ફોર્માલ્ડિહાઇડના સંગ્રહની જરૂર પડે છે, જે લાંબા ગાળાના સંગ્રહ માટે પણ વધુ છે.ઉંદરના યકૃતમાંથી કાઢવામાં આવેલ આરએનએ મૂળભૂત રીતે પાણીમાં સંગ્રહ કર્યાના એક અઠવાડિયા પછી અધોગતિ પામ્યું હતું, જ્યારે ઉંદરના બરોળમાંથી કાઢવામાં આવેલ આરએનએ ત્રણ વર્ષ સુધી પાણીમાં સંગ્રહ કર્યા પછી સ્થિર રહ્યું હતું.વધુમાં, 4kb કરતા મોટી ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ નાની ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ કરતાં RNase ડિગ્રેડેશનને ટ્રેસ કરવા માટે વધુ સંવેદનશીલ હોય છે.સંગ્રહ આરએનએ નમૂનાની સ્થિરતા વધારવા માટે, આરએનએને આયનના મેથાલમામાઇનમાં ઓગાળી શકાય છે, અને -70 °C પર સંગ્રહિત થાય છે.આરએનએને બચાવવા માટે વપરાતી થાઈલાઈડમાં આરએનએને અધોગતિ કરનાર પરચુરણ પદાર્થ ન હોવો જોઈએ.RNA, જે સ્વાદુપિંડમાંથી મેળવવામાં આવે છે, તે ઓછામાં ઓછા એક વર્ષ માટે મેથાલમામાઇનમાં સાચવી શકાય છે.જ્યારે તમે આરએનએનો ઉપયોગ કરવા માટે તૈયાર હોવ, ત્યારે તમે આરએનએને અવક્ષેપિત કરવા માટે નીચેની પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરી શકો છો: NaCl ને 0.2m અને ઇથેનોલના 4 ગણા વોલ્યુમમાં ઉમેરો, 3-5 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને મૂકો, અને 5 મિનિટ માટે 10,000 × g સેન્ટ્રીફ્યુગલ.
2. RNaseH પ્રવૃત્તિ (RNaseH-) વિના રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરો:
સીડીએનએ સંશ્લેષણની લંબાઈ અને ઉપજ વધારવા માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયાઓમાં RNase અવરોધકો ઘણીવાર ઉમેરવામાં આવે છે.બફર અને ડીટીટી જેવા ઘટાડતા એજન્ટોની હાજરીમાં પ્રથમ સાંકળ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયામાં RNase અવરોધક ઉમેરવામાં આવે છે કારણ કે પ્રી-સીડીએનએ સંશ્લેષણ પ્રક્રિયા અવરોધકને ડિનેચર કરે છે, જેનાથી આરએનએને અધોગતિ કરનારા બંધાયેલા આરનેઝને મુક્ત કરે છે.પ્રોટીન RNase અવરોધક ફક્ત RNase A, B, C દ્વારા RNA ના અધોગતિને અટકાવે છે અને ત્વચા પર RNase ને અટકાવતું નથી, તેથી આ અવરોધકોનો ઉપયોગ કરવા છતાં આંગળીઓમાંથી RNase દાખલ ન થાય તેની કાળજી લેવી જોઈએ.
રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ આરએનએના સીડીએનએમાં રૂપાંતરણને ઉત્પ્રેરિત કરે છે.એમ-એમએલવી અને એએમવી બંને તેમની પોતાની પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ ઉપરાંત અંતર્જાત RNaseH પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.RNaseH પ્રવૃત્તિ RNA ટેમ્પ્લેટ્સ અને DNA પ્રાઈમર્સ અથવા cDNA એક્સ્ટેંશન સ્ટ્રૅન્ડ્સ વચ્ચે રચાયેલી હેટરોઝાયગસ સ્ટ્રૅન્ડ્સ માટે પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ સાથે સ્પર્ધા કરે છે, અને DNA સંકુલમાં RNA: RNA સ્ટ્રૅન્ડને અધોગતિ કરે છે.RNaseH પ્રવૃત્તિ દ્વારા અધોગતિ પામેલા RNA ટેમ્પ્લેટ્સ હવે cDNA સંશ્લેષણ માટે અસરકારક સબસ્ટ્રેટ તરીકે ઉપયોગમાં લઈ શકાતા નથી, જે cDNA સંશ્લેષણની ઉપજ અને લંબાઈ ઘટાડે છે.આમ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટેઝની RNaseH પ્રવૃત્તિને નાબૂદ કરવા અથવા મોટા પ્રમાણમાં ઘટાડવાથી ઘણો ફાયદો થશે.
સુપરસ્ક્રિપ્ટⅡ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ, RNaseH- અને થર્મોસ્ક્રિપ્ટ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝના MMLV રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ, RNaseH-ના AMV-એ MMLV અને AMV કરતાં વધુ પૂર્ણ-લંબાઈના cDNA પ્રાપ્ત કર્યા છે.RT-PCR સંવેદનશીલતા સીડીએનએ સંશ્લેષણની માત્રાથી પ્રભાવિત થાય છે.થર્મોસ્ક્રિપ્ટ એએમવી કરતા વધુ સંવેદનશીલ છે.RT-PCR ઉત્પાદનોનું કદ સીડીએનએનું સંશ્લેષણ કરવા માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજની ક્ષમતા દ્વારા મર્યાદિત છે, ખાસ કરીને જ્યારે મોટા સીડીએનએનું ક્લોનિંગ કરવામાં આવે છે.MMLV ની સરખામણીમાં, SuperScripⅡ એ લાંબા RT-PCR ઉત્પાદનોની ઉપજમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો છે.RNaseH- ની રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ થર્મલ સ્થિરતા પણ વધારે છે, તેથી પ્રતિક્રિયા 37-42℃ ના સામાન્ય કરતાં વધુ તાપમાને થઈ શકે છે.સૂચવેલ સંશ્લેષણ શરતો હેઠળ, ઓલિગો(ડીટી) પ્રાઈમર અને 10μCi [આલ્ફા-પી]dCTP નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રથમ સાંકળના કુલ ઉત્પાદનની ગણતરી TCA વરસાદ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.પૂર્ણ-લંબાઈના સીડીએનએનું માપ-સૉર્ટેડ સ્ટ્રીપ દૂર કરવા અને આલ્કલાઇન એગેરોઝ જેલમાં ગણતરીનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
3. રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનનું ગરમી સંરક્ષણ તાપમાન વધારો:
ઉચ્ચ હોલ્ડિંગ તાપમાન આરએનએનું ગૌણ માળખું ખોલવામાં અને પ્રતિક્રિયાની ઉપજ વધારવામાં મદદ કરે છે.મોટાભાગના આરએનએ ટેમ્પલેટો માટે, આરએનએ અને પ્રાઈમરને 65°C પર બફર અથવા મીઠા વગર પકડી રાખવું અને પછી તેને બરફ પર ઝડપથી ઠંડું કરવાથી મોટા ભાગની ગૌણ રચનાઓ દૂર થઈ જાય છે અને પ્રાઈમરને બાંધવા દે છે.જો કે, થર્મલ ડિનેચરેશન પછી પણ કેટલાક ટેમ્પલેટ્સમાં ગૌણ માળખું હોય છે.આ મુશ્કેલ નમૂનાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન થર્મોસ્ક્રીપ્ટ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરીને અને એમ્પ્લીફિકેશનને સુધારવા માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ પ્રતિક્રિયાને ઊંચા તાપમાને મૂકીને કરી શકાય છે.ઉચ્ચ હોલ્ડિંગ તાપમાન પણ વિશિષ્ટતામાં વધારો કરી શકે છે, ખાસ કરીને જ્યારે સીડીએનએ સંશ્લેષણ જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ (જીએસપીએસ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે (જુઓ પ્રકરણ 3).જો GSP નો ઉપયોગ કરી રહ્યા હો, તો ખાતરી કરો કે પ્રાઈમરનું Tm મૂલ્ય અપેક્ષિત હોલ્ડિંગ તાપમાન જેટલું જ છે.ઓલિગો(dT) અને 60℃ ઉપરના રેન્ડમ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરશો નહીં.રેન્ડમ પ્રાઈમર 60℃ સુધી વધતા પહેલા 10 મિનિટ માટે 25℃ પર રાખવાની જરૂર છે.ઉચ્ચ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન તાપમાનનો ઉપયોગ કરવા ઉપરાંત, RNA/ પ્રાઈમર મિશ્રણને 65℃ ડિનેચરિંગ ટેમ્પરેચરથી રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન હોલ્ડિંગ ટેમ્પરેચરમાં સીધું ટ્રાન્સફર કરીને અને પ્રીહિટેડ 2× રિએક્શન મિશ્રણ (cDNA થર્મલ ઈનિશિએશન સિન્થેસિસ) ઉમેરીને વિશિષ્ટતા સુધારી શકાય છે.આ અભિગમ ઇન્ટરમોલેક્યુલર બેઝ પેરિંગને રોકવામાં મદદ કરે છે જે નીચા તાપમાને થાય છે.PCR સાધનનો ઉપયોગ RT-PCR માટે જરૂરી ઘણા તાપમાન સ્વીચોને સરળ બનાવે છે.
Tth હીટ સ્ટેબિલાઇઝ્ડ પોલિમરેઝ Mg2+ની હાજરીમાં DNA પોલિમરેઝ અને Mn2+ની હાજરીમાં RNA પોલિમરેઝ તરીકે કામ કરે છે.તે 65 ℃ સુધી ગરમી પકડી શકે છે.જો કે, PCR દરમિયાન Mn2+ ની હાજરી વફાદારી ઘટાડે છે, જે Tth પોલિમરેઝને ઉચ્ચ ચોકસાઇ એમ્પ્લીફિકેશન માટે ઓછી યોગ્ય બનાવે છે, જેમ કે cDNA ક્લોનિંગ.વધુમાં, Tth રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનમાં ઓછું કાર્યક્ષમ છે, જે સંવેદનશીલતા ઘટાડે છે, અને કારણ કે એક એન્ઝાઇમ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને પીસીઆર કરી શકે છે, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન વિના નિયંત્રણ પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ દૂષિત જીનોમિક ડીએનએમાંથી સીડીએનએના વિસ્તૃત ઉત્પાદનોને અલગ કરવા માટે કરી શકાતો નથી.
4. એડિટિવ જે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનને પ્રોત્સાહન આપે છે:
પ્રથમ સાંકળ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયામાં ગ્લિસરીન અને ડીએમએસઓ સહિતના ઉમેરણોનો ઉમેરો ન્યુક્લીક એસિડ ડબલ સ્ટ્રાન્ડની સ્થિરતાને ઘટાડી શકે છે અને આરએનએ ગૌણ માળખું ખોલી શકે છે.SuperScriptⅡ અથવા MMLV ની પ્રવૃત્તિને અસર કર્યા વિના 20% સુધી ગ્લિસરીન અથવા 10% DMSO ઉમેરી શકાય છે.AMV પ્રવૃત્તિ ઘટાડ્યા વિના 20% ગ્લિસરોલ સુધી પણ સહન કરી શકે છે.SuperScriptⅡ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શનમાં RT-PCR ની સંવેદનશીલતા વધારવા માટે, 10% ગ્લિસરોલ ઉમેરી શકાય છે અને 45℃ પર ઇન્સ્યુલેટેડ કરી શકાય છે.જો પીસીઆરમાં રેટ્રોટ્રાન્સક્રિપ્શન-રિએક્શન પ્રોડક્ટનો 1/10 ઉમેરવામાં આવે છે, તો એમ્પ્લીફિકેશન રિએક્શનમાં ગ્લિસરોલની સાંદ્રતા 0.4% છે, જે પીસીઆરને રોકવા માટે પૂરતી નથી.
5. RNaseH પ્રોસેસિંગ:
PCR પહેલા RNaseH સાથે cDNA સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયાઓની સારવાર કરીને સંવેદનશીલતા સુધારી શકાય છે.કેટલાક નમૂનાઓ માટે, એવું માનવામાં આવે છે કે સીડીએનએ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયામાં આરએનએ એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનોના બંધનને અટકાવે છે, આ કિસ્સામાં RNaseH સારવાર સંવેદનશીલતામાં વધારો કરી શકે છે.સામાન્ય રીતે, પ્રમાણમાં લાંબા પૂર્ણ-લંબાઈના cDNA લક્ષ્ય નમૂનાના એમ્પ્લીફિકેશન માટે RNaseH સારવાર જરૂરી છે, જેમ કે ઓછી નકલ સાથે ટ્યુબરસ સ્કેરોસિસⅡ.આ મુશ્કેલ નમૂના માટે, RNaseH એ SuperScriptⅡ અથવા AMV દ્વારા સંશ્લેષિત cDNA દ્વારા જનરેટ થયેલ સિગ્નલને વધારે છે.મોટાભાગની RT-PCR પ્રતિક્રિયાઓ માટે, RNaseH સારવાર વૈકલ્પિક છે કારણ કે 95℃ ઇન્સ્યુલેટેડ PCR ડિનેચરેશન સ્ટેપ સામાન્ય રીતે RNA: DNA કોમ્પ્લેક્સમાંથી RNA ને હાઇડ્રોલાઇઝ કરે છે.
6. આરએનએની નાની માત્રા શોધવા માટેની સુધારેલી પદ્ધતિઓ:
RT-PCR એ ખાસ કરીને પડકારજનક છે જ્યારે માત્ર થોડી માત્રામાં RNA ઉપલબ્ધ હોય.RNA વિભાજન દરમિયાન વાહક તરીકે ગ્લાયકોજેનનો ઉમેરો નાના નમૂનાઓની ઉપજ વધારવામાં મદદ કરે છે.RNase-મુક્ત ગ્લાયકોજેન એ જ સમયે Trizol તરીકે ઉમેરી શકાય છે.ગ્લાયકોજેન પાણીમાં દ્રાવ્ય છે અને તે પછીના વરસાદમાં મદદ કરવા માટે આરએનએ સાથે પાણીના તબક્કામાં રહી શકે છે.RNase-મુક્ત ગ્લાયકોજેનની ભલામણ કરેલ સાંદ્રતા 50mg પેશીઓ અથવા 106 સંવર્ધિત કોષો કરતા ઓછા નમૂનાઓ માટે 250μg/ml છે.
SuperScriptⅡ નો ઉપયોગ કરીને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન રિએક્શન માટે એસિટિલેટેડ BSA ઉમેરવાથી સંવેદનશીલતા વધી શકે છે, અને RNA ની થોડી માત્રા માટે, SuperScriptⅡ ની માત્રામાં ઘટાડો અને RnaseOut ન્યુક્લિઝ ઇન્હિબિટરના 40 યુનિટ ઉમેરવાથી શોધ સ્તરમાં સુધારો થઈ શકે છે.જો RNA વિભાજનમાં ગ્લાયકોજેનનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો, SuperScriptⅡ નો ઉપયોગ કરીને ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શનને રિવર્સ કરવા માટે BSA અથવા RNase ઇન્હિબિટર ઉમેરવાની હજુ પણ ભલામણ કરવામાં આવે છે.
Ⅱ. RT-PCRની વિશિષ્ટતામાં વધારો
1. cNDA સંશ્લેષણ:
પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ સીડીએનએ સંશ્લેષણ શરૂ કરવા માટે ત્રણ અલગ અલગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે, અને દરેક પદ્ધતિની સંબંધિત વિશિષ્ટતા સીડીએનએ સંશ્લેષણની માત્રા અને પ્રકારને અસર કરે છે.
રેન્ડમ પ્રાઈમર પદ્ધતિ એ ત્રણ પદ્ધતિઓમાંથી ઓછામાં ઓછી વિશિષ્ટ છે.ટૂંકી, આંશિક લંબાઈના સીડીએનએ બનાવવા માટે પ્રાઈમર્સને સમગ્ર ટ્રાન્સક્રિપ્ટમાં બહુવિધ સાઇટ્સ પર એન્નીલ કરવામાં આવે છે.આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ ઘણીવાર 5′ ટર્મિનલ સિક્વન્સ અને સીડીએનએ મેળવવા માટે થાય છે જે આરએનએ ટેમ્પ્લેટ્સમાંથી ગૌણ માળખાકીય પ્રદેશો સાથે અથવા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝ નકલ કરી શકતી નથી.સૌથી લાંબો સીડીએનએ મેળવવા માટે, દરેક આરએનએ નમૂનામાં પ્રાઇમર્સ અને આરએનએનો ગુણોત્તર પ્રયોગમૂલક રીતે નક્કી કરવો જરૂરી છે.રેન્ડમ પ્રાઇમર્સની પ્રારંભિક સાંદ્રતા 50 થી 250ng પ્રતિ 20μl પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં હોય છે.કારણ કે રેન્ડમ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને કુલ આરએનએમાંથી સંશ્લેષિત સીડીએનએ મુખ્યત્વે રિબોસોમલ આરએનએ છે, સામાન્ય રીતે પોલી(એ)+આરએનએ નમૂના તરીકે પસંદ કરવામાં આવે છે.
ઓલિગો(ડીટી) દીક્ષા રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ કરતાં વધુ ચોક્કસ છે.તે મોટાભાગના યુકેરીયોટિક કોષોમાં mRNA ના 3′ છેડે જોવા મળતી પોલી(A) પૂંછડી સાથે વર્ણસંકર બને છે.પોલી(એ)+આરએનએ કુલ આરએનએના આશરે 1% થી 2% હોવાને કારણે, સીડીએનએની માત્રા અને જટિલતા જો રેન્ડમ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો તેના કરતા ઘણી ઓછી છે.તેની ઉચ્ચ વિશિષ્ટતાને કારણે, oligo(dT) ને સામાન્ય રીતે RNA થી પ્રાઈમર રેશિયો અને પોલી(A)+ પસંદગી માટે ઓપ્ટિમાઇઝેશનની જરૂર પડતી નથી.0.5μg oligo(dT) પ્રતિ 20μl પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.oligo(dT)12-18 મોટાભાગના RT-PCR માટે યોગ્ય છે.થર્મોસ્ક્રીપ્ટ આરટી-પીસીઆર સિસ્ટમ તેની સારી થર્મલ સ્થિરતાને કારણે ઓલિગો(ડીટી)20 પ્રદાન કરે છે અને તે ઊંચા હોલ્ડિંગ તાપમાન માટે યોગ્ય છે.
રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન સ્ટેપ માટે જીન-સ્પેસિફિક પ્રાઇમર્સ (GSP) શ્રેષ્ઠ ચોક્કસ પ્રાઇમર્સ છે.જીએસપી એ એન્ટિસેન્સ ઓલિગોન્યુક્લિયોસાઇડ છે જે રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ અથવા ઓલિગો(ડીટી) જેવા તમામ આરએનએને એનલ કરવાને બદલે આરએનએ ડેસ્ટિનેશન સિક્વન્સ સાથે ખાસ કરીને હાઇબ્રિડાઇઝ કરી શકે છે.PCR પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરવા માટે વપરાતા નિયમો રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિએક્શન GSP ની ડિઝાઇન પર પણ લાગુ પડે છે.GSP એ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઈમર mRNA3′ ના અંતમાં એન્નીલ કરેલ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઈમર જેવો જ ક્રમ હોઈ શકે છે, અથવા જીએસપીને રિવર્સ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રાઈમર સાથે ડાઉનસ્ટ્રીમ એનલીડ કરવા માટે ડિઝાઇન કરી શકાય છે.કેટલાક એમ્પ્લીફાઈડ ઑબ્જેક્ટ્સ માટે, સફળ RT-PCR માટે એક કરતાં વધુ એન્ટિસેન્સ પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરવા જરૂરી છે કારણ કે લક્ષ્ય RNA નું ગૌણ માળખું પ્રાઈમરને બંધન કરતા અટકાવી શકે છે.20μl ની પ્રથમ સાંકળ સંશ્લેષણ પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમમાં 1pmol એન્ટિસેન્સ GSP નો ઉપયોગ કરવાનું સૂચન કરવામાં આવે છે.
2. રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનનું ગરમી સંરક્ષણ તાપમાન વધારો:
GSP વિશિષ્ટતાનો સંપૂર્ણ લાભ લેવા માટે, ઉચ્ચ થર્મલ સ્થિરતા સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરવો જોઈએ.પ્રતિક્રિયાની કઠોરતા વધારવા માટે ગરમી-સ્થિર રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટને ઊંચા તાપમાને અવાહક કરી શકાય છે.ઉદાહરણ તરીકે, જો GSP 55°C પર એનલ કરવામાં આવે છે, તો GSP ની વિશિષ્ટતાનો સંપૂર્ણ ઉપયોગ થતો નથી જો રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન 37°C પર AMV અથવા M-MLV નો ઉપયોગ કરીને ઓછી કઠોરતા સાથે કરવામાં આવે છે.જો કે, SuperScripⅡ અને ThermoScript 50℃ અથવા તેનાથી વધુ તાપમાને પ્રતિક્રિયા આપી શકે છે, જે નીચા તાપમાને ઉત્પાદિત બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોને દૂર કરે છે.મહત્તમ વિશિષ્ટતા માટે, આરએનએ/પ્રાઈમર મિશ્રણને પ્રીહિટેડ 2 x પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ (સીડીએનએ સંશ્લેષણની થર્મલ શરૂઆત) ના ઉમેરા સાથે 65℃ ડિનેચ્યુરેશન તાપમાનથી સીધા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન હોલ્ડિંગ તાપમાનમાં સ્થાનાંતરિત કરી શકાય છે.આ નીચા તાપમાને પરમાણુઓ વચ્ચે બેઝ પેરિંગને રોકવામાં મદદ કરે છે.PCR સાધનનો ઉપયોગ RT-PCR માટે જરૂરી ઘણા તાપમાન સંક્રમણોને સરળ બનાવે છે.
3. જીનોમિક ડીએનએ દૂષણ ઘટાડવું:
RT-PCR સાથેની એક સંભવિત મુશ્કેલી એ છે કે RNA જીનોમિક ડીએનએને દૂષિત કરે છે.વધુ સારી આરએનએ વિભાજન પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ, જેમ કે ટ્રિઝોલ રીએજન્ટ, આરએનએ તૈયારીઓમાં જીનોમિક ડીએનએ દૂષણ ઘટાડે છે.જીનોમિક ડીએનએમાંથી ઉત્પાદિત ઉત્પાદનોને ટાળવા માટે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પહેલા દૂષિત ડીએનએ દૂર કરવા માટે આરએનએને એમ્પ્લીફિકેશન ગ્રેડ DnasⅠ સાથે સારવાર કરી શકાય છે.DNaseⅠ પાચનને સમાપ્ત કરવા માટે નમૂનાઓને 10 મિનિટ માટે 2.0mM EDTA માં 65℃ પર રાખવામાં આવ્યા હતા.મેગ્નેશિયમ આયન આધારિત આરએનએ હાઇડ્રોલિસિસ કે જે ઊંચા તાપમાને થાય છે તેને રોકવા માટે EDTA મેગ્નેશિયમ આયનોને ચેલેટ કરે છે.
જીનોમ ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટમાંથી એમ્પ્લીફાઈડ સીડીએનએને અલગ કરવા માટે, પ્રાઈમર કે જે વિભાજિત એક્સોન સાથે અલગથી એનિલ કરે છે તે ડિઝાઇન કરી શકાય છે.સીડીએનએમાંથી મેળવેલા પીસીઆર ઉત્પાદનો દૂષિત જીનોમિક ડીએનએમાંથી મેળવેલા ઉત્પાદનો કરતાં ટૂંકા હશે.આપેલ ટુકડો જીનોમિક ડીએનએ અથવા સીડીએનએમાંથી છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે દરેક આરએનએ ટેમ્પ્લેટ પર વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન વિના નિયંત્રિત પ્રયોગ પણ કરવામાં આવે છે.રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનની ગેરહાજરીમાં મેળવેલ પીસીઆર ઉત્પાદનો જીનોમમાંથી મેળવવામાં આવે છે.
સંબંધિત ઉત્પાદન
-વન-સ્ટેપ કીટ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને પીસીઆરને સમાન ટ્યુબમાં હાથ ધરવામાં સક્ષમ બનાવે છે.તેને માત્ર ટેમ્પલેટ RNA, ચોક્કસ PCR પ્રાઈમર્સ અને RNase-ફ્રી ddH ઉમેરવાની જરૂર છે2O.
-આરએનએનું રીઅલ-ટાઇમ જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ ઝડપથી અને સચોટ રીતે કરી શકાય છે.
-આ કીટ એક અનન્ય ફોરજીન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રીએજન્ટ અને ફોરજીન હોટસ્ટાર ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે અને પ્રતિક્રિયાની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને વિશિષ્ટતાને અસરકારક રીતે સુધારવા માટે અનન્ય પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ સાથે જોડાય છે.
-ઓપ્ટિમાઇઝ્ડ રિએક્શન સિસ્ટમ પ્રતિક્રિયાને ઉચ્ચ તપાસ સંવેદનશીલતા, મજબૂત થર્મલ સ્થિરતા અને વધુ સારી સહનશીલતા બનાવે છે.
-gDNA દૂર કરવાની કાર્યક્ષમ ક્ષમતા, જે 2 મિનિટની અંદર નમૂનામાં gDNA દૂર કરી શકે છે.
-કાર્યક્ષમ રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન સિસ્ટમ, તે પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ cDNA ના સંશ્લેષણને પૂર્ણ કરવામાં માત્ર 15 મિનિટ લે છે.
જટિલ નમૂનાઓ: ઉચ્ચ GC સામગ્રી અને જટિલ ગૌણ માળખું ધરાવતા નમૂનાઓ પણ ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા સાથે ઉલટાવી શકાય છે.
-ઉચ્ચ-સંવેદનશીલતા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સિસ્ટમ, પીજી-લેવલ ટેમ્પ્લેટ્સ પણ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળી સીડીએનએ મેળવી શકે છે.
-રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સિસ્ટમમાં ઉચ્ચ થર્મલ સ્થિરતા છે, શ્રેષ્ઠ પ્રતિક્રિયા તાપમાન 42℃ છે અને તે હજુ પણ 50℃ પર સારું રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રદર્શન ધરાવે છે.
પોસ્ટ સમય: માર્ચ-07-2023
