1. મૂળભૂત જ્ઞાન (જો તમે પ્રાયોગિક ભાગ જોવા માંગતા હો, તો કૃપા કરીને સીધા બીજા ભાગમાં સ્થાનાંતરિત કરો)
પરંપરાગત પીસીઆરની વ્યુત્પન્ન પ્રતિક્રિયા તરીકે, રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર મુખ્યત્વે પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાના દરેક ચક્રમાં ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલના ફેરફાર દ્વારા એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટના જથ્થામાં ફેરફારનું નિરીક્ષણ કરે છે અને સીટી મૂલ્ય અને પ્રમાણભૂત વળાંક વચ્ચેના સંબંધ દ્વારા પ્રારંભિક નમૂનાનું જથ્થાત્મક રીતે વિશ્લેષણ કરે છે.
RT-PCR ના ચોક્કસ ડેટા છેઆધારરેખા, ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડઅનેસીટી મૂલ્ય.
આધારરેખા | 3જી-15મી ચક્રનું ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્ય એ બેઝલાઇન (બેઝલાઇન) છે, જે માપની પ્રસંગોપાત ભૂલને કારણે થાય છે. |
થ્રેશોલ્ડ (થ્રેશોલ્ડ): | એમ્પ્લીફિકેશન કર્વના ઘાતાંકીય વૃદ્ધિ ક્ષેત્રમાં યોગ્ય સ્થાને સેટ કરેલી ફ્લોરોસેન્સ ડિટેક્શન મર્યાદાનો સંદર્ભ આપે છે, સામાન્ય રીતે બેઝલાઇનના પ્રમાણભૂત વિચલન કરતાં 10 ગણો. |
સીટી મૂલ્ય: | તે PCR ચક્રની સંખ્યા છે જ્યારે પ્રત્યેક પ્રતિક્રિયા ટ્યુબમાં ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્ય થ્રેશોલ્ડ સુધી પહોંચે છે. Ct મૂલ્ય પ્રારંભિક નમૂનાની માત્રાના વિપરિત પ્રમાણસર છે. |
RT-PCR માટે સામાન્ય લેબલીંગ પદ્ધતિઓ:
પદ્ધતિ | ફાયદો | ખામી | એપ્લિકેશનનો અવકાશ |
SYBR ગ્રીનⅠ | વ્યાપક લાગુ, સંવેદનશીલ, સસ્તી અને અનુકૂળ | પ્રાઈમરની આવશ્યકતાઓ ઊંચી હોય છે, બિન-વિશિષ્ટ બેન્ડની સંભાવના હોય છે | તે વિવિધ લક્ષ્ય જનીનોના માત્રાત્મક વિશ્લેષણ, જનીન અભિવ્યક્તિ પર સંશોધન અને ટ્રાન્સજેનિક રિકોમ્બિનન્ટ પ્રાણીઓ અને છોડ પર સંશોધન માટે યોગ્ય છે. |
તકમાન | સારી વિશિષ્ટતા અને ઉચ્ચ પુનરાવર્તિતતા | કિંમત ઊંચી છે અને માત્ર ચોક્કસ ધ્યેયો માટે યોગ્ય છે. | પેથોજેન ડિટેક્શન, ડ્રગ રેઝિસ્ટન્સ જનીન સંશોધન, દવાની અસરકારકતાનું મૂલ્યાંકન, આનુવંશિક રોગોનું નિદાન. |
મોલેક્યુલર બીકન | ઉચ્ચ વિશિષ્ટતા, ફ્લોરોસેન્સ, ઓછી પૃષ્ઠભૂમિ | કિંમત ઊંચી છે, તે ચોક્કસ હેતુ માટે જ યોગ્ય છે, ડિઝાઇન મુશ્કેલ છે, અને કિંમત ઊંચી છે. | ચોક્કસ જનીન વિશ્લેષણ, SNP વિશ્લેષણ |
2. પ્રાયોગિક પગલાં
2.1 પ્રાયોગિક જૂથ વિશે- જૂથમાં બહુવિધ કૂવાઓ હોવા જોઈએ, અને ત્યાં જૈવિક પુનરાવર્તનો હોવા જોઈએ.
① | ખાલી નિયંત્રણ | પ્રયોગોમાં સેલ વૃદ્ધિ સ્થિતિ શોધવા માટે વપરાય છે |
② | નકારાત્મક નિયંત્રણ siRNA (બિન-વિશિષ્ટ siRNA ક્રમ) | RNAi ક્રિયાની વિશિષ્ટતા દર્શાવો.siRNA 200nM ની સાંદ્રતા પર બિન-વિશિષ્ટ તણાવ પ્રતિભાવ પ્રેરિત કરી શકે છે. |
③ | ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ નિયંત્રણ | કોષોમાં ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટની ઝેરી અસર અથવા લક્ષ્ય જનીનની અભિવ્યક્તિ પર અસરને બાકાત રાખો |
④ | લક્ષ્ય જનીન સામે siRNA | લક્ષ્ય જનીન અભિવ્યક્તિ નીચે કઠણ |
⑤ (વૈકલ્પિક) | હકારાત્મક siRNA | પ્રાયોગિક સિસ્ટમ અને ઓપરેશનલ સમસ્યાઓના નિવારણ માટે વપરાય છે |
⑥ (વૈકલ્પિક) | ફ્લોરોસન્ટ નિયંત્રણ siRNA | માઈક્રોસ્કોપ વડે સેલ ટ્રાન્સફેક્શનની કાર્યક્ષમતા જોઈ શકાય છે |
2.2 પ્રાઇમર ડિઝાઇનના સિદ્ધાંતો
એમ્પ્લીફાઇડ ફ્રેગમેન્ટનું કદ | પ્રાધાન્ય 100-150bp પર |
પ્રાઈમર લંબાઈ | 18-25bp |
જીસી સામગ્રી | 30%-70%, પ્રાધાન્ય 45%-55% |
ટીએમ મૂલ્ય | 58-60℃ |
ક્રમ | સતત T/C ટાળો;A/G સતત |
3 અંતનો ક્રમ | GC સમૃદ્ધ અથવા AT સમૃદ્ધ ટાળો;ટર્મિનલ બેઝ પ્રાધાન્ય G અથવા C છે;ટી ટાળવું શ્રેષ્ઠ છે |
પૂરકતા | પ્રાઈમરની અંદર અથવા બે પ્રાઈમર વચ્ચે 3 થી વધુ પાયાના પૂરક ક્રમને ટાળો |
વિશિષ્ટતા | પ્રાઈમરની વિશિષ્ટતાની પુષ્ટિ કરવા માટે બ્લાસ્ટ સર્ચનો ઉપયોગ કરો |
①SiRNA એ પ્રજાતિ-વિશિષ્ટ છે, અને વિવિધ પ્રજાતિઓના ક્રમ અલગ-અલગ હશે.
②SiRNA ફ્રીઝ-ડ્રાય પાવડરમાં પેક કરવામાં આવે છે, જે ઓરડાના તાપમાને 2-4 અઠવાડિયા માટે સ્થિર રીતે સંગ્રહિત કરી શકાય છે.
2.3 સાધનો અથવા રીએજન્ટ કે જે અગાઉથી તૈયાર કરવાની જરૂર છે
પ્રાઈમર (આંતરિક સંદર્ભ) | ફોરવર્ડ અને રિવર્સ બે સહિત |
પ્રાઇમર્સ (લક્ષ્ય જનીન) | ફોરવર્ડ અને રિવર્સ બે સહિત |
લક્ષ્ય Si RNA (3 સ્ટ્રીપ્સ) | સામાન્ય રીતે, કંપની 3 સ્ટ્રીપ્સનું સંશ્લેષણ કરશે અને પછી RT-PCR દ્વારા ત્રણમાંથી એકને પસંદ કરશે. |
ટ્રાન્સફેક્શન કિટ | લિપો2000 વગેરે. |
આરએનએ રેપિડ એક્સટ્રેક્શન કિટ | સંક્રમણ પછી આરએનએ નિષ્કર્ષણ માટે |
રેપિડ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કિટ | સીડીએનએ સંશ્લેષણ માટે |
પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન કીટ | 2×સુપર SYBR ગ્રીન qPCR માસ્ટર મિક્સ |
2.4 વિશિષ્ટ પ્રાયોગિક પગલાઓમાં ધ્યાન આપવાની જરૂર હોય તેવા મુદ્દાઓ અંગે:
①siRNA ટ્રાન્સફેક્શન પ્રક્રિયા
1. પ્લેટિંગ માટે, તમે 24-વેલ પ્લેટ, 12-વેલ પ્લેટ અથવા 6-વેલ પ્લેટ પસંદ કરી શકો છો (24-વેલ પ્લેટના દરેક કૂવામાં દરખાસ્ત કરાયેલ સરેરાશ RNA સાંદ્રતા લગભગ 100-300 ng/uL છે), અને કોષોની શ્રેષ્ઠ ટ્રાન્સફેક્શન ડેન્સિટી 60% -80% સુધી છે.
2. ટ્રાન્સફેક્શનના પગલાં અને ચોક્કસ આવશ્યકતાઓ સખત રીતે સૂચનાઓ અનુસાર છે.
3. ટ્રાન્સફેક્શન પછી, mRNA ડિટેક્શન (RT-PCR) અથવા 48-96 કલાકની અંદર પ્રોટીન ડિટેક્શન માટે સેમ્પલ 24-72 કલાકની અંદર એકત્રિત કરી શકાય છે (WB)
② RNA નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયા
1. બાહ્ય ઉત્સેચકો દ્વારા દૂષણ અટકાવો.તેમાં મુખ્યત્વે માસ્ક અને ગ્લોવ્ઝ પહેરવાનો સમાવેશ થાય છે;વંધ્યીકૃત પીપેટ ટીપ્સ અને ઇપી ટ્યુબનો ઉપયોગ કરીને;પ્રયોગમાં વપરાતું પાણી RNase-મુક્ત હોવું જોઈએ.
2. ઝડપી નિષ્કર્ષણ કીટમાં સૂચવ્યા મુજબ બમણું કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, જે ખરેખર શુદ્ધતા અને ઉપજમાં સુધારો કરશે.
3. કચરો પ્રવાહી RNA કૉલમને સ્પર્શવો જોઈએ નહીં.
③ RNA પરિમાણ
આરએનએ કાઢવામાં આવ્યા પછી, નેનોડ્રોપ વડે તેનું પ્રમાણ સીધું કરી શકાય છે, અને ન્યૂનતમ રીડિંગ 10ng/ul જેટલું ઓછું હોઈ શકે છે.
④ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રક્રિયા
1. RT-qPCR ની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતાને લીધે, દરેક નમૂના માટે ઓછામાં ઓછા 3 સમાંતર કૂવાઓ બનાવવી જોઈએ જેથી અનુગામી Ct ખૂબ અલગ ન હોય અથવા આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે SD ખૂબ મોટી ન હોય.
2. માસ્ટર મિક્સને વારંવાર સ્થિર અને પીગળશો નહીં.
3. દરેક ટ્યુબ/હોલને નવી ટિપથી બદલવી આવશ્યક છે!નમૂનાઓ ઉમેરવા માટે સતત સમાન પાઇપેટ ટીપનો ઉપયોગ કરશો નહીં!
4. નમૂના ઉમેર્યા પછી 96-વેલ પ્લેટ સાથે જોડાયેલ ફિલ્મને પ્લેટ સાથે સુંવાળી કરવાની જરૂર છે.તેને મશીન પર મૂકતા પહેલા સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવું શ્રેષ્ઠ છે, જેથી ટ્યુબની દિવાલ પરનું પ્રવાહી નીચે વહી શકે અને હવાના પરપોટા દૂર કરી શકે.
⑤સામાન્ય વળાંક વિશ્લેષણ
લઘુગણક વૃદ્ધિનો સમયગાળો નથી | નમૂનાની સંભવતઃ ઊંચી સાંદ્રતા |
કોઈ CT મૂલ્ય નથી | ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલો શોધવા માટેના ખોટા પગલાં; પ્રાઇમર્સ અથવા પ્રોબ્સનું અધોગતિ - તેની અખંડિતતા PAGE ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા શોધી શકાય છે; નમૂનાની અપૂરતી રકમ; નમૂનાઓનું અધોગતિ - નમૂનાની તૈયારીમાં અશુદ્ધિઓની રજૂઆત અને વારંવાર ઠંડું અને પીગળવાનું ટાળવું; |
Ct>38 | ઓછી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા;પીસીઆર ઉત્પાદન ખૂબ લાંબુ છે;વિવિધ પ્રતિક્રિયા ઘટકો અધોગતિ છે |
રેખીય એમ્પ્લીફિકેશન વળાંક | પુનરાવર્તિત ફ્રીઝ-થૉ ચક્ર અથવા પ્રકાશના લાંબા સમય સુધી સંપર્કમાં આવવાથી ચકાસણીઓ આંશિક રીતે અધોગતિ થઈ શકે છે |
ડુપ્લિકેટ છિદ્રોમાં તફાવત ખાસ કરીને મોટો છે | પ્રતિક્રિયા દ્રાવણ સંપૂર્ણપણે ઓગળ્યું નથી અથવા પ્રતિક્રિયા ઉકેલ મિશ્રિત નથી;પીસીઆર ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટનું થર્મલ બાથ ફ્લોરોસન્ટ પદાર્થોથી દૂષિત છે |
2.5 ડેટા વિશ્લેષણ વિશે
qPCR ના ડેટા પૃથ્થકરણને સંબંધિત પરિમાણ અને સંપૂર્ણ પરિમાણમાં વિભાજિત કરી શકાય છે.ઉદાહરણ તરીકે, નિયંત્રણ જૂથના કોષોની તુલનામાં સારવાર જૂથના કોષો,
X જનીનનું mRNA કેટલી વખત બદલાય છે, આ સાપેક્ષ પ્રમાણીકરણ છે;ચોક્કસ સંખ્યામાં કોષોમાં, X જનીનનું mRNA
ત્યાં કેટલી નકલો છે, આ સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ છે.સામાન્ય રીતે આપણે પ્રયોગશાળામાં જેનો સૌથી વધુ ઉપયોગ કરીએ છીએ તે સંબંધિત જથ્થાત્મક પદ્ધતિ છે.સામાન્ય રીતે,2-ΔΔct પદ્ધતિપ્રયોગોમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાય છે, તેથી અહીં ફક્ત આ પદ્ધતિને વિગતવાર રજૂ કરવામાં આવશે.
2-ΔΔct પદ્ધતિ: પ્રાપ્ત પરિણામ એ નિયંત્રણ જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનની તુલનામાં પ્રાયોગિક જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનની અભિવ્યક્તિમાં તફાવત છે.તે જરૂરી છે કે લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીન બંનેની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 100% ની નજીક હોય અને સંબંધિત વિચલન 5% થી વધુ ન હોવો જોઈએ.
ગણતરી પદ્ધતિ નીચે મુજબ છે:
Δct નિયંત્રણ જૂથ = નિયંત્રણ જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનનું ct મૂલ્ય - નિયંત્રણ જૂથમાં આંતરિક સંદર્ભ જનીનનું ct મૂલ્ય
Δct પ્રાયોગિક જૂથ = પ્રાયોગિક જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનનું ct મૂલ્ય - પ્રાયોગિક જૂથમાં આંતરિક સંદર્ભ જનીનનું ct મૂલ્ય
ΔΔct=Δct પ્રાયોગિક જૂથ-Δct નિયંત્રણ જૂથ
છેલ્લે, અભિવ્યક્તિ સ્તરમાં તફાવતના ગુણાંકની ગણતરી કરો:
ફોલ્ડ=2-ΔΔct બદલો (એક્સેલ ફંક્શનને અનુરૂપ પાવર છે)
સંબંધિત વસ્તુઓ:
પોસ્ટ સમય: મે-20-2023