1. મૂળભૂત જ્ઞાન (જો તમે પ્રાયોગિક ભાગ જોવા માંગતા હો, તો કૃપા કરીને સીધા બીજા ભાગમાં સ્થાનાંતરિત કરો)

પરંપરાગત પીસીઆરની વ્યુત્પન્ન પ્રતિક્રિયા તરીકે, રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર મુખ્યત્વે પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાના દરેક ચક્રમાં ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલના ફેરફાર દ્વારા એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટના જથ્થામાં ફેરફારનું નિરીક્ષણ કરે છે અને સીટી મૂલ્ય અને પ્રમાણભૂત વળાંક વચ્ચેના સંબંધ દ્વારા પ્રારંભિક નમૂનાનું જથ્થાત્મક રીતે વિશ્લેષણ કરે છે.

RT-PCR ના ચોક્કસ ડેટા છેઆધારરેખા, ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડઅનેસીટી મૂલ્ય.

RT-PCR માટે સામાન્ય લેબલીંગ પદ્ધતિઓ:

2. પ્રાયોગિક પગલાં

2.1 પ્રાયોગિક જૂથ વિશે- જૂથમાં બહુવિધ કૂવાઓ હોવા જોઈએ, અને ત્યાં જૈવિક પુનરાવર્તનો હોવા જોઈએ.

2.2 પ્રાઇમર ડિઝાઇનના સિદ્ધાંતો

①SiRNA એ પ્રજાતિ-વિશિષ્ટ છે, અને વિવિધ પ્રજાતિઓના ક્રમ અલગ-અલગ હશે.

②SiRNA ફ્રીઝ-ડ્રાય પાવડરમાં પેક કરવામાં આવે છે, જે ઓરડાના તાપમાને 2-4 અઠવાડિયા માટે સ્થિર રીતે સંગ્રહિત કરી શકાય છે.

2.3 સાધનો અથવા રીએજન્ટ કે જે અગાઉથી તૈયાર કરવાની જરૂર છે

2.4 વિશિષ્ટ પ્રાયોગિક પગલાઓમાં ધ્યાન આપવાની જરૂર હોય તેવા મુદ્દાઓ અંગે:

①siRNA ટ્રાન્સફેક્શન પ્રક્રિયા

1. પ્લેટિંગ માટે, તમે 24-વેલ પ્લેટ, 12-વેલ પ્લેટ અથવા 6-વેલ પ્લેટ પસંદ કરી શકો છો (24-વેલ પ્લેટના દરેક કૂવામાં દરખાસ્ત કરાયેલ સરેરાશ RNA સાંદ્રતા લગભગ 100-300 ng/uL છે), અને કોષોની શ્રેષ્ઠ ટ્રાન્સફેક્શન ડેન્સિટી 60% -80% સુધી છે.

2. ટ્રાન્સફેક્શનના પગલાં અને ચોક્કસ આવશ્યકતાઓ સખત રીતે સૂચનાઓ અનુસાર છે.

3. ટ્રાન્સફેક્શન પછી, mRNA ડિટેક્શન (RT-PCR) અથવા 48-96 કલાકની અંદર પ્રોટીન ડિટેક્શન માટે સેમ્પલ 24-72 કલાકની અંદર એકત્રિત કરી શકાય છે (WB)

② RNA નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયા

1. બાહ્ય ઉત્સેચકો દ્વારા દૂષણ અટકાવો.તેમાં મુખ્યત્વે માસ્ક અને ગ્લોવ્ઝ પહેરવાનો સમાવેશ થાય છે;વંધ્યીકૃત પીપેટ ટીપ્સ અને ઇપી ટ્યુબનો ઉપયોગ કરીને;પ્રયોગમાં વપરાતું પાણી RNase-મુક્ત હોવું જોઈએ.

2. ઝડપી નિષ્કર્ષણ કીટમાં સૂચવ્યા મુજબ બમણું કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, જે ખરેખર શુદ્ધતા અને ઉપજમાં સુધારો કરશે.

3. કચરો પ્રવાહી RNA કૉલમને સ્પર્શવો જોઈએ નહીં.

③ RNA પરિમાણ

આરએનએ કાઢવામાં આવ્યા પછી, નેનોડ્રોપ વડે તેનું પ્રમાણ સીધું કરી શકાય છે, અને ન્યૂનતમ રીડિંગ 10ng/ul જેટલું ઓછું હોઈ શકે છે.

④ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રક્રિયા

1. RT-qPCR ની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતાને લીધે, દરેક નમૂના માટે ઓછામાં ઓછા 3 સમાંતર કૂવાઓ બનાવવી જોઈએ જેથી અનુગામી Ct ખૂબ અલગ ન હોય અથવા આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે SD ખૂબ મોટી ન હોય.

2. માસ્ટર મિક્સને વારંવાર સ્થિર અને પીગળશો નહીં.

3. દરેક ટ્યુબ/હોલને નવી ટિપથી બદલવી આવશ્યક છે!નમૂનાઓ ઉમેરવા માટે સતત સમાન પાઇપેટ ટીપનો ઉપયોગ કરશો નહીં!

4. નમૂના ઉમેર્યા પછી 96-વેલ પ્લેટ સાથે જોડાયેલ ફિલ્મને પ્લેટ સાથે સુંવાળી કરવાની જરૂર છે.તેને મશીન પર મૂકતા પહેલા સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવું શ્રેષ્ઠ છે, જેથી ટ્યુબની દિવાલ પરનું પ્રવાહી નીચે વહી શકે અને હવાના પરપોટા દૂર કરી શકે.

⑤સામાન્ય વળાંક વિશ્લેષણ

2.5 ડેટા વિશ્લેષણ વિશે

qPCR ના ડેટા પૃથ્થકરણને સંબંધિત પરિમાણ અને સંપૂર્ણ પરિમાણમાં વિભાજિત કરી શકાય છે.ઉદાહરણ તરીકે, નિયંત્રણ જૂથના કોષોની તુલનામાં સારવાર જૂથના કોષો,

X જનીનનું mRNA કેટલી વખત બદલાય છે, આ સાપેક્ષ પ્રમાણીકરણ છે;ચોક્કસ સંખ્યામાં કોષોમાં, X જનીનનું mRNA

ત્યાં કેટલી નકલો છે, આ સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ છે.સામાન્ય રીતે આપણે પ્રયોગશાળામાં જેનો સૌથી વધુ ઉપયોગ કરીએ છીએ તે સંબંધિત જથ્થાત્મક પદ્ધતિ છે.સામાન્ય રીતે,2-ΔΔct પદ્ધતિપ્રયોગોમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાય છે, તેથી અહીં ફક્ત આ પદ્ધતિને વિગતવાર રજૂ કરવામાં આવશે.

2-ΔΔct પદ્ધતિ: પ્રાપ્ત પરિણામ એ નિયંત્રણ જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનની તુલનામાં પ્રાયોગિક જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનની અભિવ્યક્તિમાં તફાવત છે.તે જરૂરી છે કે લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીન બંનેની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 100% ની નજીક હોય અને સંબંધિત વિચલન 5% થી વધુ ન હોવો જોઈએ.

ગણતરી પદ્ધતિ નીચે મુજબ છે:

Δct નિયંત્રણ જૂથ = નિયંત્રણ જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનનું ct મૂલ્ય - નિયંત્રણ જૂથમાં આંતરિક સંદર્ભ જનીનનું ct મૂલ્ય

Δct પ્રાયોગિક જૂથ = પ્રાયોગિક જૂથમાં લક્ષ્ય જનીનનું ct મૂલ્ય - પ્રાયોગિક જૂથમાં આંતરિક સંદર્ભ જનીનનું ct મૂલ્ય

ΔΔct=Δct પ્રાયોગિક જૂથ-Δct નિયંત્રણ જૂથ

છેલ્લે, અભિવ્યક્તિ સ્તરમાં તફાવતના ગુણાંકની ગણતરી કરો:

ફોલ્ડ=2-ΔΔct બદલો (એક્સેલ ફંક્શનને અનુરૂપ પાવર છે)

સંબંધિત વસ્તુઓ:

સેલ ડાયરેક્ટ RT-qPCR કીટ