પરંપરાગત રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ ઊંચા તાપમાનને સહન કરી શકતા નથી (એમએમએલવી પ્રવૃત્તિ માટે શ્રેષ્ઠ તાપમાન 37-50 ° સે છે, અને એએમવી 42-60 ° સે છે).વધુ જટિલ વાયરલ આરએનએ નીચા તાપમાને સીડીએનએમાં અસરકારક રીતે રિવર્સ કરી શકાતું નથી, પરિણામે શોધ કાર્યક્ષમતામાં ઘટાડો થાય છે.પરંપરાગત RT-qPCR માટે સામાન્ય રીતે બે મુખ્ય ઉત્સેચકોની ભાગીદારીની જરૂર પડે છે (રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને DNA પોલિમરેઝ), જે પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીના સંચાલનને સરળ બનાવવા અને ખર્ચ ઘટાડવાનું અશક્ય બનાવે છે.અહીં આપણે બે ઉચ્ચ-તાપમાન-પ્રતિરોધક રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, TtH અને RevTaq રજૂ કરીશું.આ બે ઉત્સેચકોમાં ડીએનએ પોલિમરેઝનું કાર્ય પણ હોય છે, તેથી તેમને બાયફંક્શનલ એન્ઝાઇમ કહેવામાં આવે છે.

TtH DNA પોલિમરેઝ

તમે TtH વિશે સાંભળ્યું જ હશે, જે થર્મોફિલિક બેક્ટેરિયમ થર્મસ થર્મોફિલસ HB8 માંથી ઉતરી આવ્યું છે.Mg2+ જેવા દ્વિભાષી કેશનની હાજરીમાં, તે DNA પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.તે Taq એન્ઝાઇમ જેવી PCR પ્રતિક્રિયાઓમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે, પરંતુ તે Taq એન્ઝાઇમ કરતાં વધુ ગરમી પ્રતિકાર ધરાવે છે, તેથી તે ઉચ્ચ GC સામગ્રી નમૂનાઓ સાથે PCR પર વધુ સારી અસર કરે છે.

· આ એન્ઝાઇમમાં મૂળભૂત રીતે 3′→5′ exonuclease પ્રવૃત્તિ અને 5′→3′ exonuclease પ્રવૃત્તિ નથી, તેથી તેનો ઉપયોગ ડીડિયોક્સી સિક્વન્સિંગ માટે પણ થઈ શકે છે.

આ એન્ઝાઇમમાં RTase પ્રવૃત્તિ છે.Mn2+ ની હાજરીમાં, RTase પ્રવૃત્તિ વધારવામાં આવશે.આ સુવિધાનો ઉપયોગ કરીને, તેનો ઉપયોગ એક જ ટ્યુબમાં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયા અને પીસીઆર પ્રતિક્રિયા કરવા માટે થઈ શકે છે, એટલે કે, વન-સ્ટેપ RT-PCR.જો કે, Mn2+ ની હાજરીમાં, RT-PCRની ચોકસાઈ વધારે નથી.RT પ્રવૃત્તિને rnaase H પ્રવૃત્તિ સાથે કોઈ લેવાદેવા નથી.

· Tth-DNA પોલિમરેઝ (pH9, મહત્તમ +55℃～+70℃, મહત્તમ +95℃) ની વધેલી પ્રવૃત્તિ RNA ગૌણ રચનાને કારણે થતી સમસ્યાઓને દૂર કરે છે.પરિણામી cDNA ને Mg2+ આયનોની હાજરીમાં સમાન એન્ઝાઇમ વડે PCR દ્વારા વિસ્તૃત કરી શકાય છે.

· Tth-DNA પોલિમરેઝની ઊંચા તાપમાને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને DNA એમ્પ્લીફિકેશન કરવાની ક્ષમતા આ એન્ઝાઇમને માત્રાત્મક RT-PCR, ક્લોનિંગ અને સેલ્યુલર અને વાયરલ આરએનએના જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગી બનાવે છે.
· Tth-DNA પોલિમરેઝનો ઉપયોગ RT-PCR માટે RNA ને 1kb સુધી વધારવા માટે થાય છે.

લક્ષણો અને ફાયદા

Tth DNA પોલિમરેઝ:

• ઑપ્ટિમાઇઝ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (PCR) પ્રોડક્ટનું કદ, RT-PCR પ્રતિક્રિયામાં ઓછામાં ઓછું 1000 bp સુનિશ્ચિત કરો

• સબસ્ટ્રેટ તરીકે સંશોધિત ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોસાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ સ્વીકારો

• RNase H પ્રવૃત્તિ સાથે સંબંધિત નથી

• સમસ્યાઓને દૂર કરવા માટે ઉચ્ચ થર્મલ સ્થિરતા ધરાવે છે, જે સામાન્ય રીતે RNA માં હાજર ઉચ્ચ માધ્યમિક બંધારણ સાથે સંબંધિત છે

RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ પ્રવૃત્તિ સાથે ગરમી-પ્રતિરોધક DNA પોલિમરેઝ

RevTaq-RT-PCR-DNA પોલિમરેઝ એ એક એન્જિનિયર્ડ, અત્યંત ઉષ્મા-પ્રતિરોધક, દ્વિ-કાર્યકારી એન્ઝાઇમ છે જેમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને DNA પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિઓ નિર્દેશિત અને કૃત્રિમ ઉત્ક્રાંતિ દ્વારા મેળવવામાં આવે છે.

· 95°C પર RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝનું અર્ધ જીવન 40 મિનિટથી વધુ છે.

· RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ RNA ટેમ્પલેટમાંથી સીધા જ ઉચ્ચ-તાપમાનના રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનને મંજૂરી આપે છે, અને વધુ cDNA ટેમ્પલેટ્સ બનાવવા માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન સ્ટેપને ઘણી વખત પુનરાવર્તિત કરી શકાય છે.

· RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ "શૂન્ય-પગલાં" RT-PCR (કોઈ ઇસોથર્મલ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સ્ટેપ નથી) ની મંજૂરી આપે છે, કારણ કે ચક્રીય PCR એક્સ્ટેંશન સ્ટેપમાં, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને DNA એમ્પ્લીફિકેશન એક સાથે થાય છે.આ ઊંચા તાપમાને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પ્રતિક્રિયાને પણ પ્રોત્સાહન આપે છે, જેનાથી ઊંચા તાપમાને RNAમાં મજબૂત ગૌણ માળખું ઓગળવામાં આવતી સમસ્યાઓ ઓછી થાય છે.

· એપ્ટેમર-આધારિત હોટ-સ્ટાર્ટ ફોર્મ્યુલાને લીધે, રેવટાક આરટી-પીસીઆર ડીએનએ પોલિમરેઝ જ્યારે એનેલીંગ અને એક્સ્ટેંશન તાપમાન 57 ડિગ્રી સેલ્સિયસ કરતા વધારે હોય ત્યારે વધુ સારા પરિણામો આપશે.

એન્ઝાઇમ ગરમી-પ્રતિરોધક હોવાથી, ખૂબ ઊંચા ગલનબિંદુઓ (>60°C) સાથે પ્રાઇમર્સ અને પ્રોબ ડિઝાઇન કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

પ્રતિક્રિયા સેટઅપ પ્રક્રિયા દરમિયાન તાપમાનના ઢાળ દ્વારા એન્નીલિંગ/એક્સ્ટેંશન સ્ટેપના તાપમાનને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

· તાપમાન જેટલું ઊંચું હશે, પીસીઆરની વિશિષ્ટતા વધારે છે.રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન ચક્ર સામાન્ય રીતે પીસીઆર ચક્ર કરતાં ઊંચા તાપમાને કરવામાં આવે છે, કારણ કે ડીએનએ પ્રાઈમર:આરએનએ ટેમ્પલેટ હાઇબ્રિડાઇઝેશનમાં સામાન્ય રીતે ડીએનએ પ્રાઈમર:સીડીએનએ ટેમ્પલેટ ડુપ્લેક્સ કરતાં વધુ ગલનબિંદુ હોય છે.

· RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ અને ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ છે, અને એમ્પ્લિકનનું કદ 60-300 bp વચ્ચે છે.

RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ શોધ મર્યાદા 4 નકલો સુધી પહોંચે છે/

ઑપ્ટિમાઇઝ રિએક્શન સિસ્ટમ (ઉચ્ચ ગલનબિંદુ પ્રાઇમર્સની સ્થાપના) આકૃતિમાં બતાવવામાં આવી છે.RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ-સંચાલિત RT-PCR, TaqPath 1-સ્ટેપ RT-qPCR માસ્ટર મિક્સ અને લોઅર ડિટેક્શન સેમ્પલ ડિલ્યુશન ગ્રેડિયન્ટ કરતાં વધુ સારી સંવેદનશીલતા દર્શાવે છે.

વધુ ફાયદા:

ક્વિક સ્ટાર્ટ ફંક્શન → પ્રારંભિક થર્મલ ડિનેચરેશન સ્ટેપ છોડી શકાય છે.

હોટ-સ્ટાર્ટ એપ્ટેમર ફોર્મ્યુલા → તરત જ 100% એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ પ્રદાન કરો અને નીચા તાપમાને (<57°C) બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન અટકાવો.

ક્લીવેજ કાર્ય → RNA નિષ્કર્ષણ પગલું અવગણવામાં આવ્યું છે, કારણ કે RevTaq RT-PCR DNA પોલિમરેઝ ક્રૂડ પ્રતિક્રિયા નમૂનાઓ પર પણ પ્રક્રિયા કરી શકે છે.તે ગરમ RT-PCR ચક્રમાં યુકેરીયોટ્સ, બેક્ટેરિયા અને વાયરસના કોષ પટલને તરત જ નાશ કરી શકે છે.

IVD કાચા માલનું સ્તર → ઉચ્ચ ગુણવત્તાના ધોરણો અને અત્યંત સ્પર્ધાત્મક કિંમતો