• પીસીઆર એ એક પદ્ધતિ છે જેનો ઉપયોગ ડીએનએ ટેમ્પલેટની થોડી માત્રામાંથી ડીએનએને વિસ્તૃત કરવા માટે થાય છે.આરટી-પીસીઆર આરએનએ સ્ત્રોતમાંથી ડીએનએ ટેમ્પલેટ બનાવવા માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનનો ઉપયોગ કરે છે જે પછી વિસ્તૃત કરી શકાય છે.
• PCR અને RT-PCR એ સામાન્ય રીતે અંતિમ બિંદુ પ્રતિક્રિયાઓ છે, જ્યારે qPCR અને RT-qPCR PCR પ્રતિક્રિયા દરમિયાન ઉત્પાદન સંશ્લેષણના દરના ગતિશાસ્ત્રનો ઉપયોગ કરે છે જેથી તે હાજર નમૂનાની માત્રા નક્કી કરે.
• નવી પદ્ધતિઓ, જેમ કે ડિજિટલ પીસીઆર, પ્રારંભિક ડીએનએ ટેમ્પ્લેટનું સંપૂર્ણ પ્રમાણ પૂરું પાડે છે, જ્યારે આઇસોથર્મલ પીસીઆર જેવી પદ્ધતિઓ વિશ્વસનીય પરિણામો પ્રદાન કરવા માટે ખર્ચાળ સાધનોની જરૂરિયાત ઘટાડે છે.

પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (PCR) એ ડીએનએ અને આરએનએ સિક્વન્સને વિસ્તૃત કરવા અને શોધવા માટે પ્રમાણમાં સરળ અને વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતી મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીક છે.ડીએનએ ક્લોનિંગ અને એમ્પ્લીફિકેશનની પરંપરાગત પદ્ધતિઓની સરખામણીમાં, જેમાં ઘણી વખત દિવસો લાગી શકે છે, પીસીઆરને માત્ર થોડા કલાકોની જરૂર પડે છે.પીસીઆર અત્યંત સંવેદનશીલ છે અને ચોક્કસ સિક્વન્સની શોધ અને એમ્પ્લીફિકેશન માટે ન્યૂનતમ નમૂનાની જરૂર છે.મૂળભૂત પીસીઆર પદ્ધતિઓ સરળ ડીએનએ અને આરએનએ શોધથી આગળ વધી છે.નીચે, અમે તમારી સંશોધન જરૂરિયાતો માટે વિવિધ પીસીઆર પદ્ધતિઓ અને એન્ઝો લાઇફ સાયન્સમાં પ્રદાન કરીએ છીએ તે રીએજન્ટ્સની ઝાંખી આપી છે.અમે વૈજ્ઞાનિકોને તેમના આગામી સંશોધન પ્રોજેક્ટમાં ઝડપથી પીસીઆર રીએજન્ટનો ઉપયોગ કરવા માટે મદદ કરવાનો લક્ષ્યાંક રાખીએ છીએ!

પીસીઆર

માનક પીસીઆર માટે, તમારે ફક્ત ડીએનએ પોલિમરેઝ, મેગ્નેશિયમ, ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ, પ્રાઇમર્સ, એમ્પ્લીફાઇડ કરવા માટેના ડીએનએ ટેમ્પલેટ અને થર્મોસાયકલની જરૂર છે.પીસીઆર મિકેનિઝમ તેના હેતુ જેટલું સરળ છે: 1) ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ (ડીએસડીએનએ) હીટ ડિનેચર છે, 2) પ્રાઇમર્સ સિંગલ ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ્સ સાથે સંરેખિત થાય છે, અને 3) પ્રાઇમર્સ ડીએનએ પોલિમરેઝ દ્વારા વિસ્તૃત થાય છે, પરિણામે તેની બે નકલો થાય છે. મૂળ ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડ.તાપમાન અને સમયની શ્રેણીમાં વિકૃતિકરણ, એનેલીંગ અને વિસ્તરણ પ્રક્રિયાને એમ્પ્લીફિકેશનના એક ચક્ર તરીકે ઓળખવામાં આવે છે (ફિગ. 1).

ચક્રના દરેક પગલાને ઉપયોગમાં લેવાતા નમૂના અને પ્રાઈમર સેટ માટે ઑપ્ટિમાઇઝ કરવું જોઈએ.આ ચક્ર લગભગ 20-40 વખત પુનરાવર્તિત થાય છે, અને પછી એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનનું વિશ્લેષણ કરી શકાય છે, ખાસ કરીને એગેરોઝ જેલ (ફિગ. 2).

પીસીઆર એ અત્યંત સંવેદનશીલ પદ્ધતિ હોવાથી અને એકલ પ્રતિક્રિયાઓ માટે ખૂબ જ ઓછી માત્રાની આવશ્યકતા છે, તેથી ઘણી પ્રતિક્રિયાઓ માટે માસ્ટર મિક્સ તૈયાર કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.મુખ્ય મિશ્રણ સારી રીતે મિશ્રિત હોવું જોઈએ અને પછી પ્રતિક્રિયાઓની સંખ્યા દ્વારા વિભાજિત કરવું જોઈએ, ખાતરી કરો કે દરેક પ્રતિક્રિયામાં સમાન પ્રમાણમાં એન્ઝાઇમ, dNTP અને પ્રાઈમર હશે.ઘણા સપ્લાયર્સ, જેમ કે એન્ઝો લાઇફ સાયન્સ, પીસીઆર મિક્સ પણ ઓફર કરે છે જેમાં પ્રાઇમર્સ અને ડીએનએ ટેમ્પલેટ સિવાય પહેલાથી જ બધું હોય છે.

ગુઆનાઇન/સાયટોસિન-સમૃદ્ધ (GC-સમૃદ્ધ) પ્રદેશો પ્રમાણભૂત PCR તકનીકોમાં એક પડકાર રજૂ કરે છે.GC-સમૃદ્ધ સિક્વન્સ ઓછી GC સામગ્રી ધરાવતા સિક્વન્સ કરતાં વધુ સ્થિર હોય છે.વધુમાં, GC-સમૃદ્ધ સિક્વન્સ સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચર્સ બનાવવાનું વલણ ધરાવે છે, જેમ કે હેરપિન લૂપ્સ.પરિણામે, જીસી-સમૃદ્ધ ડબલ સ્ટ્રેન્ડને વિકૃતિકરણ તબક્કા દરમિયાન સંપૂર્ણપણે અલગ કરવું મુશ્કેલ છે.પરિણામે, ડીએનએ પોલિમરેઝ અવરોધ વિના નવા સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરી શકતું નથી.ઉચ્ચ વિકૃતિકરણ તાપમાન આને સુધારી શકે છે, અને ઉચ્ચ એનિલિંગ તાપમાન અને ટૂંકા એનિલિંગ સમય તરફ ગોઠવણો GC-સમૃદ્ધ પ્રાઇમર્સના અચોક્કસ બંધનને અટકાવી શકે છે.વધારાના રીએજન્ટ્સ GC-સમૃદ્ધ સિક્વન્સના એમ્પ્લીફિકેશનને વધારી શકે છે.DMSO, ગ્લિસરોલ, અને બીટેઈન GC ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને કારણે થતી ગૌણ રચનાઓને વિક્ષેપિત કરવામાં મદદ કરે છે અને ત્યાંથી ડબલ સ્ટ્રૅન્ડને અલગ કરવામાં મદદ કરે છે.

હોટ સ્ટાર્ટ પીસીઆર

અનિશ્ચિત એમ્પ્લીફિકેશન એ એક સમસ્યા છે જે પીસીઆર દરમિયાન થઈ શકે છે.પીસીઆર માટે ઉપયોગમાં લેવાતા મોટાભાગના ડીએનએ પોલિમરેઝ 68°C થી 72°C આસપાસના તાપમાનમાં શ્રેષ્ઠ રીતે કામ કરે છે.એન્ઝાઇમ, જો કે, નીચા તાપમાને પણ સક્રિય થઈ શકે છે, જોકે નીચા ડિગ્રી સુધી.એનિલિંગ તાપમાન કરતા ઘણા નીચા તાપમાને, પ્રાઈમર બિન-વિશિષ્ટ રીતે બાંધી શકે છે અને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જાય છે, પછી ભલે પ્રતિક્રિયા બરફ પર સેટ કરવામાં આવે.પોલિમરેઝ અવરોધકોનો ઉપયોગ કરીને આને અટકાવી શકાય છે જે ચોક્કસ તાપમાને પહોંચ્યા પછી જ ડીએનએ પોલિમરેઝથી અલગ થઈ જાય છે, તેથી હોટ સ્ટાર્ટ પીસીઆર શબ્દ છે.અવરોધક એ એન્ટિબોડી હોઈ શકે છે જે પ્રારંભિક વિકૃતિકરણ તાપમાન (સામાન્ય રીતે 95 ° સે) પર પોલિમરેઝ અને ડિનેચર્સને જોડે છે.

હાઇ ફિડેલિટી પોલિમરેઝ

જ્યારે ડીએનએ પોલિમરેસીસ મૂળ નમૂનાના ક્રમમાં એકદમ સચોટ રીતે વિસ્તૃત થાય છે, ત્યારે ન્યુક્લિયોટાઇડ મેચિંગમાં ભૂલો થઈ શકે છે.ક્લોનિંગ જેવી એપ્લિકેશન્સમાં મેળ ખાતી ન હોવાને કારણે કાપેલી ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ્સ અને ખોટી રીતે અનુવાદિત અથવા નિષ્ક્રિય પ્રોટીન ડાઉનસ્ટ્રીમમાં પરિણમી શકે છે.આ અસંગતતાઓને ટાળવા માટે, "પ્રૂફરીડિંગ" પ્રવૃત્તિ સાથેના પોલિમરેસને ઓળખવામાં આવ્યા છે અને વર્કફ્લોમાં સામેલ કરવામાં આવ્યા છે.પ્રથમ પ્રૂફરીડિંગ પોલિમરેઝ, Pfu, 1991 માં Pyrococcus furiosus માં ઓળખવામાં આવ્યું હતું.આ Pfu એન્ઝાઇમ 3' થી 5' એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.જેમ જેમ ડીએનએ એમ્પ્લીફાઇડ થાય છે તેમ, એક્સોનોક્લીઝ સ્ટ્રાન્ડના 3' છેડે મેળ ન ખાતા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને દૂર કરે છે.યોગ્ય ન્યુક્લિયોટાઇડ પછી બદલાઈ જાય છે, અને ડીએનએ સંશ્લેષણ ચાલુ રહે છે.ખોટા ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સની ઓળખ એ એન્ઝાઇમ સાથે યોગ્ય ન્યુક્લિયોસાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ માટે બંધનકર્તા જોડાણ પર આધારિત છે, જ્યાં બિનકાર્યક્ષમ બંધન સંશ્લેષણને ધીમું કરે છે અને યોગ્ય રિપ્લેસમેન્ટ માટે પરવાનગી આપે છે.Pfu પોલિમરેઝની પ્રૂફરીડિંગ પ્રવૃત્તિ Taq DNA પોલિમરેઝની સરખામણીમાં અંતિમ ક્રમમાં ઓછી ભૂલોમાં પરિણમે છે.તાજેતરના વર્ષોમાં, અન્ય પ્રૂફરીડિંગ ઉત્સેચકોને ઓળખવામાં આવ્યા છે, અને DNA એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન ભૂલના દરને વધુ ઘટાડવા માટે મૂળ Pfu એન્ઝાઇમમાં ફેરફાર કરવામાં આવ્યા છે.

RT-PCR

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન PCR, અથવા RT-PCR, નમૂના તરીકે RNA નો ઉપયોગ કરવાની મંજૂરી આપે છે.એક વધારાનું પગલું આરએનએની શોધ અને એમ્પ્લીફિકેશનને મંજૂરી આપે છે.આરએનએ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરીને પૂરક DNA (cDNA) માં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવામાં આવે છે.RT-PCRની સફળતા માટે RNA ટેમ્પલેટની ગુણવત્તા અને શુદ્ધતા જરૂરી છે.RT-PCRનું પ્રથમ પગલું એ DNA/RNA હાઇબ્રિડનું સંશ્લેષણ છે.રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝમાં RNase H ફંક્શન પણ હોય છે, જે હાઇબ્રિડના RNA ભાગને અધોગતિ કરે છે.સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ પરમાણુ પછી સીડીએનએમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજની ડીએનએ-આધારિત ડીએનએ પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ દ્વારા પૂર્ણ થાય છે.પ્રથમ-સ્ટ્રેન્ડ પ્રતિક્રિયાની કાર્યક્ષમતા એમ્પ્લીફિકેશન પ્રક્રિયાને અસર કરી શકે છે.અહીંથી, પ્રમાણભૂત પીસીઆર પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ સીડીએનએને વિસ્તૃત કરવા માટે થાય છે.આરટી-પીસીઆર દ્વારા આરએનએને સીડીએનએમાં પાછું લાવવાની શક્યતાના ઘણા ફાયદા છે, અને તેનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ માટે થાય છે.RNA સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ અને ખૂબ જ અસ્થિર છે, જે તેની સાથે કામ કરવાનું પડકારરૂપ બનાવે છે.તે સામાન્ય રીતે qPCR માં પ્રથમ પગલા તરીકે સેવા આપે છે, જે જૈવિક નમૂનામાં RNA ટ્રાન્સક્રિપ્ટનું પ્રમાણ દર્શાવે છે.

qPCR અને RT-qPCR

ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર (qPCR) નો ઉપયોગ અસંખ્ય એપ્લિકેશનો માટે ન્યુક્લીક એસિડને શોધવા, લાક્ષણિકતા અને પ્રમાણ નક્કી કરવા માટે થાય છે.આરટી-ક્યુપીસીઆરમાં, આરએનએ ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ્સને મોટાભાગે ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ, સીડીએનએમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિબ કરીને માપવામાં આવે છે, અને પછી qPCR પછીથી હાથ ધરવામાં આવે છે.માનક પીસીઆરની જેમ, ડીએનએ ત્રણ પુનરાવર્તિત પગલાઓ દ્વારા વિસ્તૃત થાય છે: વિકૃતિકરણ, એનેલીંગ અને વિસ્તરણ.જો કે, qPCR માં, ફ્લોરોસન્ટ લેબલીંગ PCR જેમ જેમ આગળ વધે તેમ ડેટાના સંગ્રહને સક્ષમ કરે છે.ઉપલબ્ધ પદ્ધતિઓ અને રસાયણશાસ્ત્રની શ્રેણીને કારણે આ તકનીકના ઘણા ફાયદા છે.

ડાય-આધારિત qPCR (સામાન્ય રીતે લીલો) માં, ફ્લોરોસન્ટ લેબલિંગ dsDNA બંધનકર્તા રંગનો ઉપયોગ કરીને એમ્પ્લીફાઇડ DNA અણુઓની માત્રા નક્કી કરવાની મંજૂરી આપે છે.દરેક ચક્ર દરમિયાન, ફ્લોરોસેન્સ માપવામાં આવે છે.પ્રતિકૃતિ ડીએનએની માત્રાના પ્રમાણમાં ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ વધે છે.તેથી, ડીએનએને "રીઅલ-ટાઇમ" (ફિગ. 3) માં પરિમાણિત કરવામાં આવે છે.ડાઇ-આધારિત qPCR ના ગેરફાયદા એ છે કે એક સમયે માત્ર એક જ લક્ષ્યની તપાસ કરી શકાય છે અને તે રંગ નમૂનામાં હાજર કોઈપણ ds-DNA સાથે જોડાશે.

ચકાસણી-આધારિત qPCR માં, દરેક નમૂનામાં એક સાથે ઘણા લક્ષ્યો શોધી શકાય છે, પરંતુ આ માટે પ્રાઇમર્સ ઉપરાંત ઉપયોગમાં લેવાતા લક્ષ્ય-વિશિષ્ટ ચકાસણી(ઓ)ના ઑપ્ટિમાઇઝેશન અને ડિઝાઇનની જરૂર છે.વિવિધ પ્રકારની પ્રોબ ડિઝાઇન ઉપલબ્ધ છે, પરંતુ સૌથી સામાન્ય પ્રકાર હાઇડ્રોલિસિસ પ્રોબ છે, જેમાં ફ્લોરોફોર અને ક્વેન્ચરનો સમાવેશ થાય છે.ફ્લોરોસેન્સ રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર (FRET) તપાસ અકબંધ હોય ત્યારે ક્વેન્ચર દ્વારા ફ્લોરોફોરના ઉત્સર્જનને અટકાવે છે.જો કે, પીસીઆર પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, પ્રાઈમર એક્સ્ટેંશન દરમિયાન પ્રોબને હાઇડ્રોલાઇઝ્ડ કરવામાં આવે છે અને ચોક્કસ ક્રમમાં તે બંધાયેલ હોય છે.પ્રોબનું ક્લીવેજ ફ્લોરોફોરને ક્વેન્ચરથી અલગ કરે છે અને પરિણામે ફ્લોરોસેન્સમાં એમ્પ્લીફિકેશન-આધારિત વધારો થાય છે (ફિગ. 4).આમ, ચકાસણી-આધારિત qPCR પ્રતિક્રિયામાંથી ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ નમૂનામાં હાજર પ્રોબ લક્ષ્ય ક્રમની માત્રાના પ્રમાણસર છે.કારણ કે ચકાસણી-આધારિત qPCR એ ડાઇ-આધારિત qPCR કરતાં વધુ વિશિષ્ટ છે, તે ઘણીવાર qPCR-આધારિત ડાયગ્નોસ્ટિક એસેસમાં ઉપયોગમાં લેવાતી તકનીક છે.

આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન

ઉપરોક્ત તકનીકી PCR ને ડિનેચરેશન, એનેલીંગ અને એક્સ્ટેંશન સ્ટેપ્સ માટે ચેમ્બરના તાપમાનને ચોક્કસ રીતે રેમ્પ અપ અને ડાઉન કરવા માટે ખર્ચાળ થર્મોસાયકલિંગ સાધનોની જરૂર છે.અસંખ્ય તકનીકો વિકસાવવામાં આવી છે જેને આવા ચોક્કસ ઉપકરણોની જરૂર નથી અને તે સરળ પાણીના સ્નાનમાં અથવા રસના કોષોની અંદર પણ કરી શકાય છે.આ તકનીકોને સામૂહિક રીતે આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન કહેવામાં આવે છે અને ઘાતાંકીય, રેખીય અથવા કાસ્કેડ એમ્પ્લીફિકેશન પર આધારિત કાર્ય કરે છે.

આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશનનો સૌથી જાણીતો પ્રકાર લૂપ-મીડિયેટેડ આઇસોથર્મલ એમ્પ્લીફિકેશન અથવા LAMP છે.ટેમ્પલેટ ડીએનએ અથવા આરએનએને વિસ્તૃત કરવા માટે LAMP 65⁰C પર ઘાતાંકીય એમ્પ્લીફિકેશનનો ઉપયોગ કરે છે.LAMP કરતી વખતે, લક્ષ્ય DNA ના વિસ્તારોને પૂરક એવા ચાર થી છ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ DNA પોલિમરેઝ સાથે નવા DNAનું સંશ્લેષણ કરવા માટે થાય છે.આમાંના બે પ્રાઈમર્સમાં સ્તુત્ય ક્રમ હોય છે જે અન્ય પ્રાઈમર્સમાં અનુક્રમોને ઓળખે છે અને તેમને બાંધે છે, જે નવા સંશ્લેષિત ડીએનએમાં "લૂપ" માળખું રચવા માટે પરવાનગી આપે છે જે પછી એમ્પ્લીફિકેશનના અનુગામી રાઉન્ડમાં પ્રાઈમર એનિલિંગમાં મદદ કરે છે.LAMP ને બહુવિધ પદ્ધતિઓ દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ કરી શકાય છે, જેમાં ફ્લોરોસેન્સ, એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અથવા કલોરીમેટ્રીનો સમાવેશ થાય છે.કલોરીમેટ્રી દ્વારા ઉત્પાદનની હાજરી અથવા ગેરહાજરી જોવાની અને શોધવાની સરળતા અને જરૂરી ખર્ચાળ સાધનોના અભાવે LAMP ને એવા વિસ્તારોમાં સાર્સ-કોવ-2 પરીક્ષણ માટે યોગ્ય વિકલ્પ બનાવ્યો જ્યાં ક્લિનિકલ લેબ પરીક્ષણ સહેલાઈથી ઉપલબ્ધ ન હતું, અથવા નમૂનાઓનો સંગ્રહ અને પરિવહન. શક્ય નહોતું, અથવા જે લેબમાં અગાઉ પીસીઆર થર્મોસાયકલિંગ સાધનો ન હતા.