પ્રાઈમર ડિઝાઇન આધાર (99% સમસ્યાઓ હલ કરી શકાય છે)
1. પ્રાઈમર લંબાઈ: પાઠ્યપુસ્તકને 15-30bpની જરૂર છે, સામાન્ય રીતે લગભગ 20bp.ચોક્કસતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે વાસ્તવિક સ્થિતિ 18-24bp હોવી વધુ સારી છે, પરંતુ જેટલો લાંબો તેટલો વધુ સારો, ખૂબ લાંબુ પ્રાઈમર પણ વિશિષ્ટતા ઘટાડશે અને ઉપજમાં ઘટાડો કરશે.
2. પ્રાઈમર એમ્પ્લીફિકેશન સ્પેન: 200-500bp યોગ્ય છે, અને ચોક્કસ પરિસ્થિતિઓમાં ટુકડાને 10kb સુધી વિસ્તૃત કરી શકાય છે.
3. પ્રાઈમર બેઝ: G+C ની સામગ્રી 40-60% હોવી જોઈએ, ખૂબ ઓછી G+C એમ્પ્લીફિકેશન અસર સારી નથી, ખૂબ જ G+C બિન-વિશિષ્ટ બેન્ડ્સ દેખાવા માટે સરળ છે.ATGC 5 થી વધુ પ્યુરિન અથવા પાયરીમિડીન ન્યુક્લિયોટાઇડ્સના ક્લસ્ટરોને ટાળીને, રેન્ડમ રીતે શ્રેષ્ઠ રીતે વિતરિત કરવામાં આવે છે.સ્થિરતા વધારવા માટે 5′ અંત અને મધ્યવર્તી સિક્વન્સ માટે મલ્ટિ-જીસી, 3′ છેડે સમૃદ્ધ GC ટાળો, છેલ્લા 3 પાયા માટે કોઈ GC નથી અથવા છેલ્લા 5 માંથી 3 પાયા માટે કોઈ GC નથી.
4. પ્રાઇમર્સમાં ગૌણ માળખું ટાળો, અને બે પ્રાઇમર્સ વચ્ચે પૂરકતા ટાળો, ખાસ કરીને 3' છેડે પૂરક, અન્યથા પ્રાઇમર ડાઇમર રચાશે અને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફાઇડ બેન્ડ્સ જનરેટ થશે.
5. પ્રાઈમર્સના 3' છેડા પરના પાયા, ખાસ કરીને છેલ્લા અને અંતિમ પાયા, અનપેયર્ડ ટર્મિનલ પાયાને કારણે PCR નિષ્ફળતા ટાળવા માટે સખત રીતે જોડવા જોઈએ.
6. પ્રાઇમર્સમાં યોગ્ય ક્લીવેજ સાઇટ્સ હોય છે અથવા ઉમેરી શકાય છે, અને એમ્પ્લીફાઇડ લક્ષ્ય ક્રમમાં પ્રાધાન્યમાં યોગ્ય ક્લીવેજ સાઇટ્સ હોવી જોઈએ, જે ક્લીવેજ વિશ્લેષણ અથવા મોલેક્યુલર ક્લોનિંગ માટે ખૂબ ફાયદાકારક છે.
7. પ્રાઇમરની વિશિષ્ટતા: પ્રાઇમર્સમાં ન્યુક્લીક એસિડ સિક્વન્સ ડેટાબેઝમાં અન્ય સિક્વન્સ સાથે કોઈ સ્પષ્ટ હોમોલોજી ન હોવી જોઈએ.
8. સૉફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરવાનું શીખો: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (આ ઑનલાઇન ડિઝાઇન શ્રેષ્ઠ કામ કરે છે).
ઉપરોક્ત સામગ્રી ઓછામાં ઓછી 99% પ્રાઈમર ડિઝાઇન સમસ્યાઓ હલ કરી શકે છે.
પ્રાઈમર ડિઝાઇનની વિગતોને નિયંત્રિત કરો
1. પ્રાઇમર લંબાઈ
સામાન્ય પ્રાઈમર લંબાઈ 18~30 પાયા છે.સામાન્ય રીતે, પ્રાઈમરના એનિલિંગ તાપમાનને નિર્ધારિત કરતું સૌથી મહત્વપૂર્ણ પરિબળ એ પ્રાઈમરની લંબાઈ છે.પ્રાઈમરનું એનિલિંગ તાપમાન સામાન્ય રીતે પસંદ કરવામાં આવે છે (Tm મૂલ્ય -5℃), અને કેટલાક સીધા જ Tm મૂલ્યનો ઉપયોગ કરે છે.નીચેના સૂત્રોનો ઉપયોગ પ્રાઇમર્સના એનિલિંગ તાપમાનની અંદાજે ગણતરી કરવા માટે કરી શકાય છે.
જ્યારે પ્રાઈમરની લંબાઈ 20bp કરતાં ઓછી હોય: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
જ્યારે પ્રાઈમરની લંબાઈ 20bp કરતાં વધુ હોય: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/લંબાઈ-5℃
આ ઉપરાંત, એન્નીલિંગ તાપમાનની ગણતરી કરવા માટે ઘણા સૉફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરી શકાય છે, ગણતરી સિદ્ધાંત અલગ હશે, તેથી કેટલીકવાર ગણતરી કરેલ મૂલ્યમાં નાનું અંતર હોઈ શકે છે.પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે, શ્રેષ્ઠ કાર્યક્ષમતા અને વિશિષ્ટતા માટે 54℃ કરતા ઓછા ન હોય તેવા એન્નીલિંગ તાપમાનની ખાતરી કરતા ટૂંકા પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.
એકંદરે, પ્રાઈમરની વિશિષ્ટતા દરેક વધારાના ન્યુક્લિયોટાઈડ માટે ચારના પરિબળથી વધે છે, જેથી મોટાભાગની એપ્લિકેશનો માટે લઘુત્તમ પ્રાઈમર લંબાઈ 18 ન્યુક્લિયોટાઈડ હોય છે.પ્રાઈમર લંબાઈની ઉપલી મર્યાદા ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ નથી, મુખ્યત્વે પ્રતિક્રિયા કાર્યક્ષમતા સાથે સંબંધિત છે.એન્ટ્રોપીના કારણે, પ્રાઈમર જેટલો લાંબો હોય છે, તેટલો ઓછો દરે તે લક્ષ્ય DNA સાથે જોડાય છે અને DNA પોલિમરેઝને બાંધવા માટે સ્થિર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડ ટેમ્પલેટ બનાવે છે.
પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવા માટે સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરતી વખતે, પ્રાઇમરની લંબાઈ બદલામાં TM મૂલ્ય દ્વારા નક્કી કરી શકાય છે, ખાસ કરીને ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક પીસીઆરના પ્રાઇમર્સ માટે, TM=60℃ અથવા તેથી વધુ નિયંત્રિત હોવું જોઈએ.
2.GC સામગ્રી
સામાન્ય રીતે, પ્રાઈમર સિક્વન્સમાં G+C ની સામગ્રી 40%~60% હોય છે, અને GC સામગ્રી અને પ્રાઈમરની જોડીની Tm મૂલ્ય સંકલિત હોવી જોઈએ.જો પ્રાઈમરમાં ગંભીર GC અથવા AT વલણ હોય, તો A, T અથવા G અને C પૂંછડીની યોગ્ય માત્રા પ્રાઈમરના 5' છેડામાં ઉમેરી શકાય છે.
3. એનિલિંગ તાપમાન
એનિલિંગ તાપમાન અનચેન તાપમાન કરતા 5℃ ઓછું હોવું જોઈએ.જો પ્રાઈમર બેઝની સંખ્યા ઓછી હોય, તો એનિલિંગ તાપમાન યોગ્ય રીતે વધારી શકાય છે, જે પીસીઆરની વિશિષ્ટતામાં વધારો કરી શકે છે.જો પાયાની સંખ્યા મોટી હોય, તો એનેલિંગ તાપમાન યોગ્ય રીતે ઘટાડી શકાય છે.4℃ ~ 6℃ ના પ્રાઈમરની જોડી વચ્ચેના એનિલિંગ તાપમાનનો તફાવત PCR ઉપજને અસર કરશે નહીં, પરંતુ આદર્શ રીતે પ્રાઇમરની જોડીનું એનિલિંગ તાપમાન સમાન છે, જે 55℃ ~ 75℃ વચ્ચે બદલાઈ શકે છે.
4. એમ્પ્લીફિકેશન ટેમ્પલેટના ગૌણ માળખું વિસ્તારને ટાળો
એમ્પ્લીફાઇડ ફ્રેગમેન્ટ પસંદ કરતી વખતે ટેમ્પ્લેટના ગૌણ માળખાના પ્રદેશને ટાળવું શ્રેષ્ઠ છે.ટાર્ગેટ ફ્રેગમેન્ટનું સ્થિર ગૌણ માળખું સંબંધિત કોમ્પ્યુટર સોફ્ટવેર દ્વારા અનુમાન અને અનુમાન કરી શકાય છે, જે નમૂનાની પસંદગી માટે મદદરૂપ છે.પ્રાયોગિક પરિણામો દર્શાવે છે કે વિસ્તરણ ઘણીવાર અસફળ હોય છે જ્યારે વિસ્તરણ કરવા માટેના પ્રદેશની મુક્ત ઊર્જા (△G) 58.6lkJ/mol કરતાં ઓછી હોય.
5. લક્ષ્ય DNA સાથે મેળ ખાતો નથી
જ્યારે એમ્પ્લીફાઈડ લક્ષ્ય DNA ક્રમ મોટો હોય છે, ત્યારે પ્રાઈમર લક્ષ્ય DNA ના બહુવિધ ભાગો સાથે જોડાઈ શકે છે, પરિણામે પરિણામમાં બહુવિધ બેન્ડ દેખાય છે.આ વખતે BLAST સોફ્ટવેર ટેસ્ટિંગ, વેબસાઇટનો ઉપયોગ કરવો જરૂરી છે:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.બે સિક્વન્સ સંરેખિત કરો (bl2seq) પસંદ કરો.
ઝોન 1 પર પ્રાઈમર સિક્વન્સ અને લક્ષ્ય DNA સિક્વન્સને ઝોન 2 પર ચોંટાડવા એ વિનિમયક્ષમ છે, અને BLAST પૂરક, એન્ટિસેન્સ અને અન્ય શક્યતાઓની ગણતરી કરે છે, તેથી વપરાશકર્તાઓને ધ્યાનમાં લેવાની જરૂર નથી કે બંને સાંકળો સેન્સ ચેન છે કે કેમ.જો તમને ડેટાબેઝમાં ક્રમનો GI નંબર ખબર હોય તો તમે GI નંબર પણ દાખલ કરી શકો છો, તેથી તમારે ક્રમનો મોટો ભાગ પેસ્ટ કરવાની જરૂર નથી.છેલ્લે, લક્ષ્ય DNA માં પ્રાઈમરમાં બહુવિધ હોમોલોગસ સાઇટ્સ છે કે કેમ તે જોવા માટે 3 પર સંરેખિત કરો પર ક્લિક કરો.
6. પ્રાઈમર ટર્મિનલ
પ્રાઈમરનો 3' છેડો એ છે જ્યાં એક્સ્ટેંશન શરૂ થાય છે, તેથી અસંગતતાઓને ત્યાં શરૂ થતી અટકાવવી મહત્વપૂર્ણ છે.3'નો અંત સતત 3 G અથવા C કરતાં વધુ ન હોવો જોઈએ, કારણ કે આનાથી G+C સંવર્ધન ક્રમ ક્ષેત્રમાં પ્રાઈમર ભૂલથી ટ્રિગર થઈ જશે.3' છેડો કોઈપણ ગૌણ માળખું બનાવી શકતો નથી, સિવાય કે વિશિષ્ટ PCR (AS-PCR) પ્રતિક્રિયાઓમાં, પ્રાઈમરનો 3′ છેડો મેળ ખાતો નથી.ઉદાહરણ તરીકે, જો એન્કોડિંગ ક્ષેત્ર એમ્પ્લીફાઈડ હોય, તો કોડનની ત્રીજી સ્થિતિ પર પ્રાઈમરનો 3' છેડો સમાપ્ત થવો જોઈએ નહીં, કારણ કે કોડનની ત્રીજી સ્થિતિ ડિજનરેટ થવાની સંભાવના છે, જે એમ્પ્લીફિકેશનની વિશિષ્ટતા અને કાર્યક્ષમતાને અસર કરશે.જોડાણ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરતી વખતે, કોડન ઉપયોગ કોષ્ટકનો સંદર્ભ લો, જૈવિક પસંદગી પર ધ્યાન આપો, 3′ છેડે જોડાણ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરશો નહીં, અને પ્રાઇમર્સની ઊંચી સાંદ્રતા (1uM-3uM) નો ઉપયોગ કરો.
7. પ્રાઇમર્સની ગૌણ રચના
પ્રાઈમર્સમાં પૂરક સિક્વન્સ ન હોવા જોઈએ, અન્યથા પ્રાઈમર પોતે જ હેરપિન સ્ટ્રક્ચરમાં ફોલ્ડ થઈ જશે, અને આ ગૌણ માળખું સ્ટેરિક અવરોધને કારણે પ્રાઇમર્સ અને ટેમ્પ્લેટ્સના બંધનને અસર કરશે.જો કૃત્રિમ નિર્ણયનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો, પ્રાઈમર્સના સતત પૂરક પાયા 3bp કરતા વધારે ન હોવા જોઈએ.બે પ્રાઈમર વચ્ચે કોઈ પૂરકતા હોવી જોઈએ નહીં, ખાસ કરીને પ્રાઈમર ડાયમરની રચનાને રોકવા માટે 3' છેડાના પૂરક ઓવરલેપને ટાળવું જોઈએ.સામાન્ય રીતે, પ્રાઈમરની જોડી વચ્ચે સતત 4 થી વધુ બેઝ હોમોલોજી અથવા પૂરકતા હોવી જોઈએ નહીં.
8. માર્કર અથવા સ્થાન ઉમેરો
5' એન્ડની એમ્પ્લીફિકેશન વિશિષ્ટતા પર ઓછી અસર છે અને તેથી એમ્પ્લીફિકેશન વિશિષ્ટતાને અસર કર્યા વિના તેમાં ફેરફાર કરી શકાય છે.પ્રાઈમર 5 'એન્ડના ફેરફારમાં શામેલ છે: એન્ઝાઇમ પ્રતિબંધ સાઇટ ઉમેરવાનું;લેબલવાળા બાયોટિન, ફ્લોરોસેન્સ, ડિગોક્સિન, Eu3+, વગેરે. પ્રોટીન બંધનકર્તા DNA સિક્વન્સનો પરિચય;મ્યુટેશન સાઇટ્સનો પરિચય, મ્યુટેશન સિક્વન્સ દાખલ કરવા અને ખૂટે છે અને પ્રમોટર સિક્વન્સનો પરિચય કરાવવો વગેરે. વધારાના પાયા એમ્પ્લીફિકેશનની કાર્યક્ષમતાને વધુ કે ઓછી અસર કરશે અને પ્રાઈમર ડાઇમરની રચનાની તકમાં વધારો કરશે, પરંતુ આગળના પગલા માટે કેટલીક છૂટ આપવી જોઈએ.વધારાના સિક્વન્સ કે જે લક્ષ્ય ક્રમ પર અસ્તિત્વમાં નથી, જેમ કે પ્રતિબંધ સાઇટ્સ અને પ્રમોટર સિક્વન્સ, વિશિષ્ટતાને અસર કર્યા વિના પ્રાઈમરના 5′ છેડે ઉમેરી શકાય છે.આ સિક્વન્સ પ્રાઈમર Tm મૂલ્યોની ગણતરીમાં સમાવિષ્ટ નથી, પરંતુ પૂરકતા અને આંતરિક ગૌણ માળખું માટે પરીક્ષણ કરવું જોઈએ.
9. સબક્લોન્સ
મોટા ભાગના સમયે, પીસીઆર એ માત્ર પ્રારંભિક ક્લોનિંગ હોય છે, અને પછી આપણે વિવિધ વેક્ટર્સમાં લક્ષ્ય ટુકડાને સબક્લોન કરવાની જરૂર છે, તેથી અમારે પીસીઆર પગલામાં આગળની કામગીરી માટે વધારાના પાયા ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે.
સબક્લોનિંગ માટે રચાયેલ કેટલાક સિક્વન્સનો સારાંશ નીચે આપેલ છે.
પ્રતિબંધ એન્ડોન્યુક્લીઝ પ્રતિબંધ સાઇટ ઉમેરવામાં આવી હતી
એન્ઝાઇમ પ્રતિબંધ સાઇટ્સ ઉમેરવા એ પીસીઆર ઉત્પાદનોને સબક્લોન કરવા માટે સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે.સામાન્ય રીતે, ક્લીવેજ સાઇટ છ પાયા છે, ક્લીવેજ સાઇટના 5 'અંત ઉપરાંત 2 ~ 3 રક્ષણાત્મક પાયા ઉમેરવાની જરૂર છે.જો કે, વિવિધ ઉત્સેચકો દ્વારા જરૂરી રક્ષણાત્મક પાયાની સંખ્યા અલગ છે.ઉદાહરણ તરીકે, SalⅠ ને કોઈ રક્ષણાત્મક આધારની જરૂર નથી, EcoRⅤ ને 1 રક્ષણાત્મક આધારની જરૂર છે, NotⅠ ને 2 રક્ષણાત્મક પાયાની જરૂર છે, અને Hind Ⅲ ને 3 રક્ષણાત્મક પાયાની જરૂર છે.
LIC પૂંછડી ઉમેરે છે
LIC નું આખું નામ લિગેશન-સ્વતંત્ર ક્લોનિંગ છે, એક ક્લોનિંગ પદ્ધતિ જેની શોધ નેવોજેન દ્વારા ખાસ કરીને તેના પીઈટી વેક્ટરના ભાગ માટે કરવામાં આવી છે.એલઆઈસી પદ્ધતિ દ્વારા તૈયાર કરાયેલ પીઈટી કેરિયરમાં બિન-પૂરક 12-15 બેઝ સિંગલ સ્ટ્રેન્ડ સ્ટીકી છેડા હોય છે, જે ટાર્ગેટ ઇન્સર્ટ ફ્રેગમેન્ટ પર અનુરૂપ સ્ટીકી છેડાને પૂરક બનાવે છે.એમ્પ્લીફિકેશન હેતુઓ માટે, દાખલ કરેલા ટુકડાનો પ્રાઈમર 5′ ક્રમ એ LIC વેક્ટરને પૂરક બનાવવો જોઈએ.T4 DNA પોલિમરેઝની 3′→5′ એક્સટ્રેક્ટ એક્ટિવિટી થોડા સમય પછી દાખલ કરેલા ટુકડા પર એક સ્ટ્રાન્ડ સ્ટીકી છેડો બનાવી શકે છે.કારણ કે ઉત્પાદન ફક્ત તૈયાર ઇન્સર્ટ ફ્રેગમેન્ટ અને વેક્ટરના પરસ્પર એનિલિંગથી જ બની શકે છે, આ પદ્ધતિ ખૂબ જ ઝડપી અને કાર્યક્ષમ છે, અને તે નિર્દેશિત ક્લોનિંગ છે.
નિર્દેશિત TA ક્લોન એડ પૂંછડી
TA ક્લોનિંગ ટુકડાને વેક્ટરમાં લક્ષ્ય બનાવવામાં અસમર્થ હતું, તેથી પાછળથી ઇન્વિટ્રોજેને એક વેક્ટર રજૂ કર્યું જે ક્લોનિંગને લક્ષ્ય બનાવી શકે, જેમાં એક છેડે ચાર અગ્રણી GTGGS હતા.તેથી, પીસીઆર પ્રાઈમર્સની ડિઝાઇનમાં, પૂરક ક્રમને તે મુજબ ઉમેરવામાં આવવો જોઈએ, જેથી ટુકડાઓ "ઓરિએન્ટેડ" થઈ શકે.
જો તમારી પાસે સમય ઓછો હોય, તો તમે જનીનને વેક્ટર સાથે જોડીને ડાયરેક્ટ સિન્થેસિસ અજમાવી શકો છો, જેને આપણે મ્યુઝિક્યુલરમાં ET જીન સિન્થેસિસ કહીએ છીએ.
D. ઇન-ફ્યુઝન ક્લોનિંગ પદ્ધતિ
કોઈ ligase જરૂરી નથી, લાંબા પ્રતિક્રિયા જરૂરી નથી.પ્રાઇમરની ડિઝાઇનમાં જ્યાં સુધી લીનિયરાઇઝ્ડ વેક્ટરના બંને છેડા પર ક્રમ દાખલ કરવામાં આવે છે, ત્યાં સુધી PCR પ્રોડક્ટ અને લાઇનરાઇઝ્ડ વેક્ટરને BSA ધરાવતા ઇન-ફ્યુઝન એન્ઝાઇમ સોલ્યુશનમાં ઉમેરવામાં આવે છે અને અડધા કલાક માટે ઓરડાના તાપમાને મૂકવામાં આવે છે, ટ્રાન્સફોર્મેશન કરી શકાય છે.આ પદ્ધતિ મોટા વોલ્યુમ રૂપાંતર માટે ખાસ કરીને યોગ્ય છે.
10. પ્રાઈમર મર્જ કરો
કેટલીકવાર, પ્રાઈમર ડિઝાઇન વિશે માત્ર મર્યાદિત ક્રમ માહિતી જાણીતી હોય છે.ઉદાહરણ તરીકે, જો માત્ર એમિનો એસિડ ક્રમ જાણીતો હોય, તો મર્જિંગ પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરી શકાય છે.મર્જર પ્રાઈમર એ વિવિધ સિક્વન્સનું મિશ્રણ છે જે એક જ એમિનો એસિડને એન્કોડ કરતી તમામ વિવિધ આધાર શક્યતાઓને રજૂ કરે છે.વિશિષ્ટતા વધારવા માટે, તમે વિવિધ સજીવોની મૂળભૂત ઉપયોગની પસંદગીઓ અનુસાર જોડાણ ઘટાડવા માટે કોડન ઉપયોગ કોષ્ટકનો સંદર્ભ લઈ શકો છો.હાયપોક્સેન્થિનને બાળપોથીના એનિલિંગ તાપમાનને ઘટાડવા માટે તમામ પાયા સાથે જોડી શકાય છે.પ્રાઈમરના 3′ છેડે જોડાયેલા પાયાનો ઉપયોગ કરશો નહીં કારણ કે 3′ છેડે છેલ્લા 3 પાયાની એનિલિંગ ખોટી જગ્યાએ PCR શરૂ કરવા માટે પૂરતી છે.ઉચ્ચ પ્રાઈમર સાંદ્રતા (1μM થી 3μM) નો ઉપયોગ થાય છે કારણ કે ઘણા જોડાણ મિશ્રણમાં પ્રાઇમર્સ લક્ષ્ય નમૂના માટે વિશિષ્ટ નથી.
પીસીઆર કાચો માલનિયંત્રણ
1. પ્રિમર જથ્થો
દરેક પ્રાઈમરની સાંદ્રતા 0.1 ~ 1umol અથવા 10 ~ 100pmol છે.પ્રાઇમરની સૌથી ઓછી માત્રા સાથે જરૂરી પરિણામ ઉત્પન્ન કરવું વધુ સારું છે.પ્રાઈમરની ઊંચી સાંદ્રતા અસંગતતા અને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનું કારણ બને છે અને પ્રાઇમર્સ વચ્ચે ડાઇમર્સ બનાવવાની તકમાં વધારો કરે છે.
2. પ્રાઇમર એકાગ્રતા
પ્રાઇમર્સની સાંદ્રતા વિશિષ્ટતાને અસર કરે છે.શ્રેષ્ઠ પ્રાઈમર સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે 0.1 અને 0.5μM વચ્ચે હોય છે.ઉચ્ચ પ્રાઈમર સાંદ્રતા બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોના એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જાય છે.
3. બાળપોથીનું એનિલિંગ તાપમાન
પ્રાઇમર્સ માટેનું બીજું મહત્વનું પરિમાણ એ ગલન તાપમાન (Tm) છે.આ તે તાપમાન છે જ્યારે 50% પ્રાઇમર્સ અને પૂરક સિક્વન્સ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ પરમાણુઓ તરીકે રજૂ થાય છે.PCR એનેલીંગ તાપમાન સેટ કરવા માટે Tm જરૂરી છે.આદર્શ રીતે, લક્ષ્ય ક્રમ સાથે પ્રાઇમર્સની અસરકારક એનિલિંગની ખાતરી કરવા માટે એનિલિંગ તાપમાન એટલું ઓછું છે, પરંતુ બિન-વિશિષ્ટ બંધન ઘટાડવા માટે પૂરતું ઊંચું છે.55℃ થી 70℃ સુધી વાજબી એનેલીંગ તાપમાન.એનિલિંગ તાપમાન સામાન્ય રીતે પ્રાઈમરના Tm કરતા 5℃ ઓછું સેટ કરવામાં આવે છે.
Tm સેટ કરવા માટે ઘણા સૂત્રો છે, જે વપરાયેલ ફોર્મ્યુલા અને પ્રાઇમર્સના ક્રમના આધારે મોટા પ્રમાણમાં બદલાય છે.કારણ કે મોટાભાગના સૂત્રો અંદાજિત Tm મૂલ્ય પ્રદાન કરે છે, બધા એન્નીલિંગ તાપમાન માત્ર એક પ્રારંભિક બિંદુ છે.ક્રમશઃ એનિલિંગ તાપમાનમાં વધારો કરતી કેટલીક પ્રતિક્રિયાઓનું વિશ્લેષણ કરીને વિશિષ્ટતા સુધારી શકાય છે.અંદાજિત Tm-5℃ થી નીચે શરૂ કરો અને ધીમે ધીમે 2℃ ના વધારામાં એનિલિંગ તાપમાનમાં વધારો કરો.ઉચ્ચ એનિલિંગ તાપમાન પ્રાઈમર ડાયમર્સ અને બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોની રચનામાં ઘટાડો કરશે.શ્રેષ્ઠ પરિણામો માટે, બે પ્રાઇમર્સમાં અંદાજિત Tm મૂલ્યો હોવા જોઈએ.જો પ્રાઈમર જોડીનો Tm તફાવત 5℃ કરતાં વધુ હોય, તો પ્રાઈમર ચક્રમાં નીચા એનલીંગ તાપમાનનો ઉપયોગ કરીને નોંધપાત્ર ખોટી શરૂઆત બતાવશે.જો બે પ્રાઇમર્સ Tm અલગ હોય, તો એનિલિંગ તાપમાનને સૌથી નીચા Tm કરતા 5℃ નીચું સેટ કરો.વૈકલ્પિક રીતે, વિશિષ્ટતા વધારવા માટે, પાંચ ચક્રો પહેલા ઊંચા Tm માટે રચાયેલ એનિલિંગ તાપમાન પર કરી શકાય છે, ત્યારબાદ બાકીના ચક્રો નીચલા Tm માટે રચાયેલ એનિલિંગ તાપમાન પર કરી શકાય છે.આ ગંતવ્ય નમૂનાની આંશિક નકલને ચુસ્ત પરિસ્થિતિઓમાં મેળવવાની મંજૂરી આપે છે.
4. પ્રાઈમર શુદ્ધતા અને સ્થિરતા
કસ્ટમ પ્રાઇમરની પ્રમાણભૂત શુદ્ધતા મોટાભાગની પીસીઆર એપ્લિકેશનો માટે પર્યાપ્ત છે.ડિસલ્ટીંગ દ્વારા બેન્ઝોયલ અને આઇસોબ્યુટીલીલ જૂથોને દૂર કરવું ન્યૂનતમ છે અને તેથી તે પીસીઆરમાં દખલ કરતું નથી.સંશ્લેષણ પ્રક્રિયામાં કોઈપણ બિન-સંપૂર્ણ-લંબાઈના સિક્વન્સને દૂર કરવા માટે કેટલીક એપ્લિકેશનોને શુદ્ધિકરણની જરૂર છે.ડીએનએ સંશ્લેષણ રસાયણશાસ્ત્રની કાર્યક્ષમતા 100% ન હોવાને કારણે આ કાપેલી શ્રેણીઓ થાય છે.આ એક ગોળાકાર પ્રક્રિયા છે જે પુનરાવર્તિત રાસાયણિક પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરે છે કારણ કે દરેક આધાર 3′ થી 5′ સુધી DNA બનાવવા માટે ઉમેરવામાં આવે છે.તમે કોઈપણ ચક્રમાં નિષ્ફળ થઈ શકો છો.લાંબા પ્રાઇમર્સ, ખાસ કરીને 50 થી વધુ પાયા, કાપેલા સિક્વન્સનું મોટું પ્રમાણ ધરાવે છે અને તેને શુદ્ધિકરણની જરૂર પડી શકે છે.
પ્રાઇમર્સની ઉપજ કૃત્રિમ રસાયણશાસ્ત્ર અને શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિની કાર્યક્ષમતા દ્વારા પ્રભાવિત થાય છે.બાયોફાર્માસ્યુટિકલ કંપનીઓ, જેમ કે સાયટોલોજી અને શેનગોંગ, ઓલિગોન્યુક્લિયોસાઇડના કુલ આઉટપુટની ખાતરી કરવા માટે તમામ ન્યૂનતમ OD યુનિટનો ઉપયોગ કરે છે.કસ્ટમ પ્રાઇમર્સ ડ્રાય પાવડર સ્વરૂપમાં મોકલવામાં આવે છે.પ્રાઇમર્સને TE માં ફરીથી વિસર્જન કરવું શ્રેષ્ઠ છે જેથી અંતિમ સાંદ્રતા 100μM હોય.ડીયોનાઇઝ્ડ પાણી કરતાં TE વધુ સારું છે કારણ કે પાણીનું pH ઘણીવાર એસિડિક હોય છે અને તે ઓલિગોન્યુક્લિયોસાઇડ્સના હાઇડ્રોલિસિસનું કારણ બને છે.
પ્રાઇમર્સની સ્થિરતા સ્ટોરેજની સ્થિતિ પર આધારિત છે.સુકા પાવડર અને ઓગળેલા પ્રાઇમર્સ -20℃ પર સંગ્રહિત કરવા જોઈએ.TE માં 10μM કરતાં વધુ સાંદ્રતામાં ઓગળેલા પ્રાઇમર્સને 6 મહિના માટે -20℃ પર સ્થિર રીતે સંગ્રહિત કરી શકાય છે, પરંતુ માત્ર 1 અઠવાડિયા કરતાં ઓછા સમય માટે ઓરડાના તાપમાને (15℃ થી 30℃) પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે.સુકા પાવડર પ્રાઇમર્સને ઓછામાં ઓછા 1 વર્ષ માટે -20 સે અને ઓરડાના તાપમાને (15 સે થી 30 સે) 2 મહિના સુધી સંગ્રહિત કરી શકાય છે.
5. ઉત્સેચકો અને તેમની સાંદ્રતા
હાલમાં, વપરાયેલ Taq DNA પોલિમરેઝ મૂળભૂત રીતે કોલિફોર્મ બેક્ટેરિયા દ્વારા સંશ્લેષિત જીન એન્જિનિયરિંગ એન્ઝાઇમ છે.લાક્ષણિક PCR પ્રતિક્રિયાને ઉત્પ્રેરિત કરવા માટે જરૂરી એન્ઝાઇમની માત્રા લગભગ 2.5U છે (100ul ની કુલ પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમનો સંદર્ભ આપે છે).જો સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી હોય, તો તે બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી શકે છે;જો સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો કૃત્રિમ ઉત્પાદનની માત્રામાં ઘટાડો થશે.
6. ડીએનટીપીની ગુણવત્તા અને સાંદ્રતા
ડીએનટીપીની ગુણવત્તા પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનની સાંદ્રતા અને કાર્યક્ષમતા સાથે ગાઢ રીતે સંબંધિત છે.dNTP પાવડર દાણાદાર હોય છે, અને જો તેને અયોગ્ય રીતે સંગ્રહિત કરવામાં આવે તો તેની પરિવર્તનશીલતા તેની જૈવિક પ્રવૃત્તિ ગુમાવે છે.dNTP સોલ્યુશન એસીડીક છે, અને તેનો ઉપયોગ 1M NaOH અથવા 1M Tris.HCL બફર સોલ્યુશન સાથે, તેના PH ને 7.0 ~ 7.5, ઓછી માત્રામાં પેટા-પેકેજિંગ, -20℃ પર સ્થિર સંગ્રહ કરવા માટે, ઉચ્ચ સાંદ્રતામાં થવો જોઈએ.મલ્ટીપલ ફ્રીઝ-પીગળવું dNTP ને ડિગ્રેજ કરશે.PCR પ્રતિક્રિયામાં, dNTP 50 ~ 200umol/L હોવો જોઈએ.ખાસ કરીને, ચાર DNTPS ની સાંદ્રતા પર ધ્યાન આપવું જોઈએ સમાન હોવું જોઈએ (સમાન મોલ તૈયારી).જો તેમાંના કોઈપણ એકની સાંદ્રતા અન્ય (ઉચ્ચ કે નીચી) કરતા અલગ હોય, તો મેળ ખાતી નથી.ખૂબ ઓછી સાંદ્રતા પીસીઆર ઉત્પાદનોની ઉપજમાં ઘટાડો કરશે.dNTP Mg2+ સાથે જોડાઈ શકે છે અને મફત Mg2+ ની સાંદ્રતા ઘટાડી શકે છે.
7. ટેમ્પલેટ (લક્ષ્ય જનીન) ન્યુક્લીક એસિડ
ટેમ્પલેટ ન્યુક્લીક એસિડની માત્રા અને શુદ્ધિકરણ ડિગ્રી એ પીસીઆરની સફળતા અથવા નિષ્ફળતા માટેની મુખ્ય કડીઓમાંની એક છે.પરંપરાગત ડીએનએ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિઓ સામાન્ય રીતે નમૂનાઓને પચાવવા અને નિકાલ કરવા માટે SDS અને પ્રોટીઝ K નો ઉપયોગ કરે છે.એસડીએસના મુખ્ય કાર્યો છે: કોષ પટલ પર લિપિડ્સ અને પ્રોટીનને ઓગાળે છે, આમ મેમ્બ્રેન પ્રોટીનને ઓગાળીને કોષ પટલનો નાશ કરે છે, અને કોષમાં પરમાણુ પ્રોટીનને અલગ કરી શકે છે, એસડીએસ પણ પ્રોટીન અને અવક્ષેપ સાથે જોડાઈ શકે છે;પ્રોટીઝ K પ્રોટીનને હાઈડ્રોલાઈઝ અને ડાયજેસ્ટ કરી શકે છે, ખાસ કરીને ડીએનએ સાથે બંધાયેલા હિસ્ટોન્સ, અને પછી પ્રોટીન અને અન્ય કોષ ઘટકો કાઢવા માટે કાર્બનિક દ્રાવક ફિનોલ અને ક્લોરોફોર્મનો ઉપયોગ કરે છે, અને ન્યુક્લિક એસિડને અવક્ષેપિત કરવા માટે ઇથેનોલ અથવા આઇસોપ્રોપીલ આલ્કોહોલનો ઉપયોગ કરે છે.અર્કિત ન્યુક્લિક એસિડનો ઉપયોગ પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓ માટે નમૂના તરીકે થઈ શકે છે.સામાન્ય ક્લિનિકલ ડિટેક્શન નમુનાઓ માટે, ઝડપી અને સરળ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કોશિકાઓ વિસર્જન કરવા, પેથોજેન્સ લિસેટ કરવા, રંગસૂત્રોમાંથી મુક્ત લક્ષ્ય જનીનોમાં પ્રોટીનને ડાયજેસ્ટ કરવા અને દૂર કરવા અને પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન માટે સીધો ઉપયોગ કરી શકાય છે.આરએનએ ટેમ્પ્લેટ નિષ્કર્ષણ સામાન્ય રીતે ગ્વાનિડિન આઇસોથિયોસાયનેટ અથવા પ્રોટીઝ K પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરે છે જેથી આરએનએઝને આરએનએને બગાડતા અટકાવી શકાય.
8.Mg2+ સાંદ્રતા
Mg2+ PCR એમ્પ્લીફિકેશનની વિશિષ્ટતા અને ઉપજ પર નોંધપાત્ર અસર કરે છે.સામાન્ય PCR પ્રતિક્રિયામાં, જ્યારે વિવિધ dNTP ની સાંદ્રતા 200umol/L હોય છે, Mg2+ ની યોગ્ય સાંદ્રતા 1.5 ~ 2.0mmol/L છે.Mg2+ સાંદ્રતા ખૂબ વધારે છે, પ્રતિક્રિયાની વિશિષ્ટતા ઘટે છે, બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન થાય છે, ખૂબ ઓછી સાંદ્રતા Taq DNA પોલિમરેઝની પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો કરશે, પરિણામે પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોમાં ઘટાડો થશે.
મેગ્નેશિયમ આયનો પીસીઆરના અનેક પાસાઓને અસર કરે છે, જેમ કે ડીએનએ પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ, જે ઉપજને અસર કરે છે;બીજું ઉદાહરણ પ્રાઈમર એનેલીંગ છે, જે વિશિષ્ટતાને અસર કરે છે.dNTP અને ટેમ્પલેટ મેગ્નેશિયમ આયન સાથે જોડાય છે, જે એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ માટે જરૂરી ફ્રી મેગ્નેશિયમ આયનની માત્રા ઘટાડે છે.શ્રેષ્ઠ મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતા વિવિધ પ્રાઈમર જોડીઓ અને નમૂનાઓ માટે બદલાય છે, પરંતુ 200μM dNTP સાથે સામાન્ય PCR શરૂ થતી સાંદ્રતા 1.5mM છે (નોંધ: વાસ્તવિક સમયના માત્રાત્મક PCR માટે, ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ સાથે 3 થી 5mM મેગ્નેશિયમ આયન સોલ્યુશનનો ઉપયોગ કરો).મુક્ત મેગ્નેશિયમ આયનોની ઊંચી સાંદ્રતા ઉપજમાં વધારો કરે છે, પરંતુ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનમાં પણ વધારો કરે છે અને વફાદારી ઘટાડે છે.શ્રેષ્ઠ સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે, મેગ્નેશિયમ આયન ટાઇટ્રેશન 0.5mM ના વધારામાં 1mM થી 3mM સુધી કરવામાં આવ્યું હતું.મેગ્નેશિયમ આયન ઑપ્ટિમાઇઝેશન પર નિર્ભરતા ઘટાડવા માટે, પ્લેટિનમ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.પ્લેટિનમ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ કરતાં મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતાની વિશાળ શ્રેણી પર કાર્ય જાળવવામાં સક્ષમ છે અને તેથી ઓછા ઑપ્ટિમાઇઝેશનની જરૂર છે.
9. પીસીઆર-પ્રમોટિંગ એડિટિવ્સ
એન્નીલિંગ તાપમાન, પ્રાઈમર ડિઝાઇન અને મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતાનું ઑપ્ટિમાઇઝેશન મોટાભાગના નમૂનાઓના અત્યંત વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન માટે પૂરતું છે;જો કે, ઉચ્ચ GC સામગ્રીવાળા નમૂનાઓ સહિત કેટલાક નમૂનાઓને વધારાના પગલાંની જરૂર છે.ડીએનએના ગલન તાપમાનને અસર કરતા ઉમેરણો ઉત્પાદનની વિશિષ્ટતા અને ઉપજને સુધારવાનો બીજો રસ્તો પૂરો પાડે છે.શ્રેષ્ઠ પરિણામો માટે નમૂનાનું સંપૂર્ણ વિકૃતિકરણ જરૂરી છે.
વધુમાં, ગૌણ માળખું બાળપોથી બંધનકર્તા અને એન્ઝાઇમના વિસ્તરણને અટકાવે છે.
PCR ઉમેરણો, જેમાં ફોર્મામાઇડ, DMSO, ગ્લિસરીન, બીટેઇન અને PCRx એન્હાન્સર સોલ્યુશનનો સમાવેશ થાય છે, એમ્પ્લીફિકેશનને વધારે છે.તેમની સંભવિત પદ્ધતિ ગલન તાપમાનને ઘટાડવાનું છે, આમ પ્રાઇમર્સને એનિલિંગમાં મદદ કરે છે અને ગૌણ માળખાના પ્રદેશ દ્વારા ડીએનએ પોલિમરેઝ વિસ્તરણમાં મદદ કરે છે.PCRx સોલ્યુશનના અન્ય ફાયદા છે.જ્યારે પ્લેટિનમ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ અને પ્લેટિનમ પીએફએક્સ ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરવામાં આવે ત્યારે ન્યૂનતમ મેગ્નેશિયમ આયન ઓપ્ટિમાઇઝેશન જરૂરી છે.આમ, ત્રીજા અભિગમ, મેગ્નેશિયમ આયન ઓપ્ટિમાઇઝેશનની અવલંબન ઘટાડતી વખતે વિશિષ્ટતા વધારવા માટે પ્લેટિનમ ટેકનિકને એડિટિવ સાથે જોડવામાં આવે છે.શ્રેષ્ઠ પરિણામો માટે, ઉમેરણોની સાંદ્રતા ઑપ્ટિમાઇઝ કરવી જોઈએ, ખાસ કરીને DMSO, ફોર્મમાઇડ અને ગ્લિસરોલ, જે Taq DNA પોલિમરેઝને અવરોધે છે.
10. ગરમ શરૂઆત
હોટ સ્ટાર્ટ પીસીઆર એ સારી પ્રાઈમર ડીઝાઈન ઉપરાંત પીસીઆર વિશિષ્ટતા સુધારવા માટેની સૌથી મહત્વપૂર્ણ પદ્ધતિઓ પૈકીની એક છે.Taq DNA પોલિમરેઝનું શ્રેષ્ઠ વિસ્તરણ તાપમાન 72℃ હોવા છતાં, પોલિમરેઝ ઓરડાના તાપમાને સક્રિય રહે છે.આમ, પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની તૈયારી દરમિયાન અને થર્મલ ચક્રની શરૂઆતમાં જ્યારે હોલ્ડિંગ તાપમાન એનિલિંગ તાપમાન કરતા ઓછું હોય ત્યારે બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોનું ઉત્પાદન થાય છે.એકવાર રચના થઈ જાય, આ બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનો અસરકારક રીતે વિસ્તૃત થાય છે.હોટ-સ્ટાર્ટ પીસીઆર ખાસ કરીને અસરકારક છે જ્યારે પ્રાઇમર ડિઝાઇન માટે ઉપયોગમાં લેવાતી સાઇટ્સ આનુવંશિક તત્વોના સ્થાન દ્વારા મર્યાદિત હોય છે, જેમ કે સાઇટ-નિર્દેશિત પરિવર્તન, અભિવ્યક્તિ ક્લોનિંગ અથવા ડીએનએ એન્જિનિયરિંગ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા આનુવંશિક તત્વોનું બાંધકામ અને મેનીપ્યુલેશન.
ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝની પ્રવૃત્તિને મર્યાદિત કરવાની એક સામાન્ય પદ્ધતિ બરફ પર પીસીઆર પ્રતિક્રિયા સોલ્યુશન તૈયાર કરવી અને તેને પહેલાથી ગરમ પીસીઆર ઉપકરણમાં મૂકવું છે.આ પદ્ધતિ સરળ અને સસ્તી છે, પરંતુ તે એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને પૂર્ણ કરતી નથી અને તેથી બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોના એમ્પ્લીફિકેશનને સંપૂર્ણપણે દૂર કરતી નથી.
થર્મલ પ્રાઈમિંગ એક આવશ્યક ઘટકને અટકાવીને ડીએનએ સંશ્લેષણમાં વિલંબ કરે છે જ્યાં સુધી પીસીઆર ઉપકરણ વિકૃત તાપમાન સુધી પહોંચે નહીં.ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝના વિલંબિત ઉમેરણ સહિતની મોટાભાગની મેન્યુઅલ થર્મલ દીક્ષા પદ્ધતિઓ બોજારૂપ છે, ખાસ કરીને ઉચ્ચ-થ્રુપુટ એપ્લિકેશનો માટે.અન્ય થર્મલ પ્રાઇમિંગ પદ્ધતિઓ મેગ્નેશિયમ આયનો અથવા ઉત્સેચકો સહિત આવશ્યક ઘટકને બંધ કરવા અથવા ટેમ્પલેટ્સ અને બફર્સ જેવા પ્રતિક્રિયાશીલ ઘટકોને શારીરિક રીતે અલગ કરવા માટે મીણ ઢાલનો ઉપયોગ કરે છે.થર્મલ સાયકલ દરમિયાન, મીણ પીગળી જાય ત્યારે વિવિધ ઘટકો છૂટા પડે છે અને એકસાથે મિશ્રિત થાય છે.મેન્યુઅલ હોટ સ્ટાર્ટ પદ્ધતિની જેમ, વેક્સ શિલ્ડ પદ્ધતિ બોજારૂપ અને દૂષિત થવાની સંભાવના છે અને ઉચ્ચ થ્રુપુટ એપ્લિકેશન માટે યોગ્ય નથી.
પ્લેટિનમ ડીએનએ પોલિમરેઝ ઓટોમેટિક હોટ સ્ટાર્ટ પીસીઆર માટે અનુકૂળ અને કાર્યક્ષમ છે.પ્લેટિનમ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝમાં તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ સામે મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી સાથે રિકોમ્બિનન્ટ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝનો સમાવેશ થાય છે.લાંબા સમય સુધી તાપમાન હોલ્ડિંગ દરમિયાન એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને રોકવા માટે પીસીઆર દ્વારા એન્ટિબોડીઝ બનાવવામાં આવે છે.Taq DNA પોલિમરેઝને ડિનેચરેશન સ્ટેપના 94℃ ઇન્સ્યુલેશન દરમિયાન પ્રતિક્રિયામાં છોડવામાં આવ્યું હતું, જે સંપૂર્ણ પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિને પુનઃસ્થાપિત કરે છે.થર્મલ શરૂઆત માટે રાસાયણિક રીતે સંશોધિત Taq DNA પોલિમરેઝથી વિપરીત, પ્લેટિનમ એન્ઝાઇમને પોલિમરેઝને સક્રિય કરવા માટે 94℃ (10 થી 15 મિનિટ) પર લાંબા સમય સુધી ઇન્સ્યુલેશનની જરૂર નથી.PlatinumTaq DNA પોલિમરેઝ સાથે, 90% Taq DNA પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ 2 મિનિટ પછી 94℃ પર પુનઃસ્થાપિત કરવામાં આવી હતી.
11. નેસ્ટ-પીસીઆર
નેસ્ટેડ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને એમ્પ્લીફિકેશનના ક્રમિક રાઉન્ડ ચોક્કસતા અને સંવેદનશીલતાને સુધારી શકે છે.પ્રથમ રાઉન્ડ એ 15 થી 20 ચક્રનું પ્રમાણભૂત એમ્પ્લીફિકેશન છે.પ્રારંભિક એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટનો એક નાનો અંશ 100 થી 1000 વખત પાતળો કરવામાં આવ્યો હતો અને 15 થી 20 ચક્ર માટે એમ્પ્લીફિકેશનના બીજા રાઉન્ડમાં ઉમેરવામાં આવ્યો હતો.વૈકલ્પિક રીતે, પ્રારંભિક એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનને જેલ શુદ્ધિકરણ દ્વારા માપી શકાય છે.એમ્પ્લીફિકેશનના બીજા રાઉન્ડમાં નેસ્ટેડ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ થાય છે, જે પ્રથમ પ્રાઈમરની અંદર લક્ષ્ય ક્રમ સાથે જોડાઈ શકે છે.નેસ્ટેડ પીસીઆરનો ઉપયોગ બહુવિધ લક્ષ્ય સાઇટ્સના એમ્પ્લીફિકેશનની શક્યતાને ઘટાડે છે કારણ કે પ્રાઇમરના બંને સેટ માટે પૂરક થોડા લક્ષ્ય ક્રમ છે.સમાન પ્રાઇમર્સ સાથેના ચક્રની સમાન કુલ સંખ્યા (30 થી 40) બિન-વિશિષ્ટ સાઇટ્સને વિસ્તૃત કરે છે.નેસ્ટેડ PCR મર્યાદિત લક્ષ્ય ક્રમની સંવેદનશીલતા વધારે છે (દા.ત., દુર્લભ mrnas) અને મુશ્કેલ PCRS (દા.ત. 5′ RACE) ની વિશિષ્ટતા સુધારે છે.
12. ઉતરતા પીસીઆર
ડીસેન્ડિંગ પીસીઆર પીસીઆરના પ્રથમ થોડા ચક્રો માટે ચુસ્ત એનલીંગ શરતોનો ઉપયોગ કરીને વિશિષ્ટતાને સુધારે છે.ચક્ર અનુમાનિત Tm કરતા આશરે 5℃ વધારે એનલીંગ તાપમાને શરૂ થાય છે, ત્યારબાદ દરેક ચક્ર 1℃ થી 2℃ સુધી ઘટાડી દેવામાં આવે છે જ્યાં સુધી એનીલિંગ તાપમાન Tm 5℃ ની નીચે ન આવે.માત્ર સર્વોચ્ચ સમાનતા ધરાવતા ગંતવ્ય નમૂનાને વિસ્તૃત કરવામાં આવશે.આ ઉત્પાદનો અનુગામી ચક્રમાં વિસ્તરણ કરવાનું ચાલુ રાખે છે, એમ્પ્લીફાઇડ બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનોને ભીડ કરે છે.ડિસેન્ડિંગ પીસીઆર એ પદ્ધતિઓ માટે ઉપયોગી છે જ્યાં પ્રાઈમર અને ટાર્ગેટ ટેમ્પ્લેટ વચ્ચેના હોમોલોજીની ડિગ્રી જાણીતી નથી, જેમ કે AFLP DNA ફિંગરપ્રિંટિંગ.
સંબંધિત PCR કિટ્સ
2× પીસીઆર હીરોTMમિક્સ સિસ્ટમમાં સામાન્ય પીસીઆર મિક્સ સિસ્ટમ કરતાં પીસીઆર અવરોધકોને વધુ સહનશીલતા હોય છે, અને તે વિવિધ જટિલ નમૂનાઓના પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનનો સરળતાથી સામનો કરી શકે છે.અનન્ય પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી અને ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા Taq Hero PCR પ્રતિક્રિયાને ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા, વિશિષ્ટતા અને સંવેદનશીલતા બનાવે છે.
ઉચ્ચ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા
તેમાં 5'→3' DNA પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ અને 5'→3' એક્સોનોક્લીઝ પ્રવૃત્તિ છે, 3'→5' એક્સોનોક્લીઝ પ્રવૃત્તિ વિના.
રીયલ ટાઈમ પીસીઆર સરળ-SYBR ગ્રીન I કિટ
ચોક્કસ-ઓપ્ટિમાઇઝ બફર અને હોટ-સ્ટાર્ટ ટાક એન્ઝાઇમ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન અને પ્રાઇમર ડાઇમરની રચનાને અટકાવી શકે છે
ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા - નમૂનાની ઓછી નકલો શોધી શકે છે
આ કીટ એક અનન્ય ફોરજીન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રીએજન્ટ અને ફોરજીન હોટસ્ટાર ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે અને પ્રતિક્રિયાની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને વિશિષ્ટતાને અસરકારક રીતે સુધારવા માટે અનન્ય પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ સાથે જોડાય છે.
પોસ્ટ સમય: મે-09-2023
