તપાસની વિશિષ્ટતા

મોટાભાગના કિસ્સાઓમાં, પ્રાઈમર ડિઝાઇનનો હેતુ પીસીઆરની વિશિષ્ટતાને મહત્તમ કરવાનો છે.આ ઘણા ચલોના વધુ કે ઓછા અનુમાનિત પ્રભાવ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે.એક મહત્વપૂર્ણ ચલ એ પ્રાઈમરના 3′છેડા પરનો ક્રમ છે.

મહત્ત્વપૂર્ણ રીતે, વિશિષ્ટતા માટે રચાયેલ પીસીઆર પરીક્ષણો વિશાળ ગતિશીલ શ્રેણીમાં ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા જાળવવાની વધુ શક્યતા ધરાવે છે, કારણ કે પરખ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોનું ઉત્પાદન કરતી નથી, તેથી પીસીઆર રીએજન્ટ્સ સાથે સ્પર્ધા કરે છે અથવા મુખ્ય એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાને અટકાવે છે.

અલબત્ત, કેટલાક કિસ્સાઓમાં, વિશિષ્ટતા એ સૌથી મહત્વપૂર્ણ નથી, ઉદાહરણ તરીકે, જ્યારે ધ્યેય નજીકથી સંબંધિત પરંતુ વિવિધ પેથોજેન્સનું પ્રમાણ નક્કી કરવાનું હોય, ત્યારે વિશેષ ડિઝાઇન, ઑપ્ટિમાઇઝેશન અને ચકાસણી ધોરણો જરૂરી હોય છે.

મેલ્ટિંગ કર્વ એ એમ્પ્લિકન્સની વિશિષ્ટતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટેની એક પ્રમાણભૂત પદ્ધતિ છે, ઓછામાં ઓછા એક લક્ષ્યને વિસ્તૃત કરવું કે કેમ તે સંદર્ભમાં.જો કે, તેના પર ભાર મૂકવો આવશ્યક છે કે ગલન વણાંકો ભ્રામક હોઈ શકે છે કારણ કે, ઉદાહરણ તરીકે, તેઓ સબઓપ્ટીમલ પ્રાઇમર્સ અને ઓછી ટેમ્પલેટ સાંદ્રતાની સંયુક્ત અસરોથી પ્રભાવિત થઈ શકે છે.

P5 |મેલ્ટિંગ કર્વ બે લક્ષ્ય ડીએનએની વિવિધ માત્રાના બે શોધમાંથી મેળવેલ Tm શિફ્ટ દર્શાવે છે.

A. ઉચ્ચ સાંદ્રતા (એડ) પર, qPCR માપન પૂર્ણ થયા પછી કોઈ સ્પષ્ટ પ્રાઈમર ડાયમર નથી.જેમ જેમ ટેમ્પલેટની સાંદ્રતા ઘટીને 50 નકલો (e) થાય છે, તેમ બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદન દેખાવાનું શરૂ થાય છે અને સૌથી ઓછી સાંદ્રતા (f) પર એકમાત્ર ઉત્પાદન બની જાય છે.

B. પરીક્ષણમાં તમામ લક્ષ્ય સાંદ્રતા પર સમાન Tms રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા, અને સૌથી ઓછી સાંદ્રતા (5 નકલો) પર પણ કોઈ સ્પષ્ટ પ્રાઈમર ડાયમર નહોતું.આ બે શોધ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરતી વખતે, એનટીસીમાં કોઈ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનો મળ્યાં નથી.

P5 નમૂનાઓ સાથે મેળવેલ વિસર્જન વણાંકો દર્શાવે છે જેમાં ટેમ્પલેટ વિવિધ સાંદ્રતામાં હાજર છે.P 5a બતાવે છે કે બે સૌથી ઓછી સાંદ્રતા પર, ઉત્પાદિત બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનોના Tms ચોક્કસ એમ્પ્લિકન્સ કરતા ઓછા છે.

દેખીતી રીતે, ઓછી સાંદ્રતામાં અસ્તિત્વમાં રહેલા લક્ષ્યોને શોધવા માટે આ શોધ પદ્ધતિનો વિશ્વસનીય રીતે ઉપયોગ કરી શકાતો નથી.

રસપ્રદ વાત એ છે કે, NTCs, એટલે કે, DNA વગરના નમૂનાઓએ (બિન-વિશિષ્ટ) એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટ્સ રેકોર્ડ કર્યા નથી, જે દર્શાવે છે કે પૃષ્ઠભૂમિ જીનોમિક ડીએનએ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન/પોલિમરાઇઝેશનમાં ભાગ લઈ શકે છે.

કેટલીકવાર આવા પૃષ્ઠભૂમિ પ્રાઇમર્સ અને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનો ઉપાય કરી શકાતો નથી, પરંતુ ઘણી વખત એવી શોધ પદ્ધતિ ડિઝાઇન કરવી શક્ય છે કે જેમાં કોઈપણ ટેમ્પલેટ સાંદ્રતા અને NTC (P 5b) માં બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ન હોય.

અહીં, 35 ના Cq સાથે લક્ષ્ય સાંદ્રતાના એમ્પ્લીફિકેશનને પણ રેકોર્ડ કરવાથી ચોક્કસ વિસર્જન વળાંક ઉત્પન્ન થશે.એ જ રીતે, NTC એ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનના કોઈ ચિહ્નો દર્શાવ્યા નથી.કેટલીકવાર, શોધની વર્તણૂક મધર લિકર પર આધારિત હોઈ શકે છે, અને અમુક બફર કમ્પોઝિશનમાં માત્ર બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન જોવા મળે છે, જે વિવિધ Mg2+ સાંદ્રતા સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે.

તપાસની સ્થિરતા

Ta નું ઑપ્ટિમાઇઝેશન એ qPCR શોધની પ્રયોગમૂલક ચકાસણી અને ઑપ્ટિમાઇઝેશન પ્રક્રિયામાં ઉપયોગી પગલું છે.તે તાપમાન (અથવા તાપમાન શ્રેણી) બતાવીને પ્રાઈમર સેટની મજબૂતાઈનો સીધો સંકેત આપે છે જે NTC ને એમ્પ્લીફાઈ કર્યા વિના સૌથી નીચો Cq ઉત્પન્ન કરે છે.

ઉચ્ચ mRNA અભિવ્યક્તિ ધરાવતા લોકો માટે સંવેદનશીલતામાં બે થી ચાર ગણો તફાવત મહત્વનો ન હોઈ શકે, પરંતુ ડાયગ્નોસ્ટિક પરીક્ષણો માટે, તેનો અર્થ હકારાત્મક અને ખોટા નકારાત્મક પરિણામો વચ્ચેનો તફાવત હોઈ શકે છે.

qPCR પ્રાઈમરના Ta ગુણધર્મો મોટા પ્રમાણમાં બદલાઈ શકે છે.કેટલાક પરીક્ષણો ખૂબ મજબૂત હોતા નથી, અને જો તે પ્રાઇમર્સના શ્રેષ્ઠ Ta મૂલ્ય હેઠળ કરવામાં ન આવે તો, તે ઝડપથી તૂટી જશે.

આ મહત્વપૂર્ણ છે કારણ કે વાસ્તવિક દુનિયામાં આ પ્રકારની શોધ ઘણીવાર સમસ્યારૂપ હોય છે, અને નમૂનાની શુદ્ધતા, ડીએનએની સાંદ્રતા અથવા અન્ય ડીએનએની હાજરી શ્રેષ્ઠ ન હોઈ શકે.

વધુમાં, લક્ષ્ય નકલ નંબર વિશાળ શ્રેણીમાં બદલાઈ શકે છે, અને રીએજન્ટ્સ, પ્લાસ્ટિકના વાસણો અથવા સાધનો ટેસ્ટ સેટ કરતી વખતે ઉપયોગમાં લેવાતા કરતા અલગ હોઈ શકે છે.

P6|ટેમ્પરેચર ગ્રેડિયન્ટ પીસીઆર ડિટેક્શનની વિવિધ મજબૂતતા દર્શાવે છે.

A. માનવ મગજના RNA માંથી તૈયાર cDNA પર PCR કરવા માટે Biolineના Sensifast SYBR માસ્ટરમિક્સ (કેટલોગ નંબર BIO-98050) નો ઉપયોગ કરો.

B. એપલીન (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGTGGTGATCTCCTAGG) ના એમ્પ્લીફિકેશન મેપ અને વિસર્જન વળાંકને રેકોર્ડ કરવા માટે Bio-Rad ના CFX qPCR સાધનનો ઉપયોગ કરો.

C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCGGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) નો એમ્પ્લીફિકેશન ગ્રાફ અને મેલ્ટિંગ કર્વ.

D. એમ્પ્લીફિકેશન ગ્રાફ અને GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).

E. 7C તાપમાનના ઢાળ હેઠળ નોંધાયેલ Cq માં તફાવત દર્શાવતા, વિવિધ એનિલિંગ તાપમાને નોંધાયેલ Cqs.

P 6 એક અનિચ્છનીય પરીક્ષણનું લાક્ષણિક પરિણામ દર્શાવે છે, જ્યાં qPCR 59C અને 67C (P 6a) ની વચ્ચેના ગ્રેડિયન્ટ Tas નો ઉપયોગ કરીને ત્રણ માનવ મગજ-વિશિષ્ટ જનીનો માટે પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.

એમ્પ્લીફિકેશન ગ્રાફ પરથી તે જોઈ શકાય છે કે ઓપાલિન પ્રાઇમર્સ આદર્શથી દૂર છે કારણ કે તેમની શ્રેષ્ઠ Ta શ્રેણી ખૂબ જ સાંકડી છે (આકૃતિ 6b), એટલે કે, Cqs વ્યાપક રીતે વિખરાયેલા છે, પરિણામે Cqs તેમની શ્રેષ્ઠ Cqs નીચી સરખામણીમાં નોંધપાત્ર રીતે જોવા મળે છે.

આ શોધ પદ્ધતિ અસ્થિર છે અને સબઓપ્ટિમલ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી શકે છે.તેથી, પ્રાઇમરની આ જોડીને ફરીથી ડિઝાઇન કરવી જોઈએ.વધુમાં, મેલ્ટિંગ કર્વ વિશ્લેષણ (ઇનસેટ) દર્શાવે છે કે આ શોધ પદ્ધતિની વિશિષ્ટતા પણ સમસ્યારૂપ હોઈ શકે છે, કારણ કે દરેક Ta ના ગલન વળાંક અલગ છે.

P 6c માં બતાવેલ ACSBG1 શોધ પદ્ધતિ ઉપરની Opalin શોધ પદ્ધતિ કરતાં વધુ મજબૂત છે, પરંતુ તે હજુ પણ આદર્શથી દૂર છે, અને સંભવ છે કે તેને સુધારી શકાય છે.

જો કે, અમે ભારપૂર્વક કહીએ છીએ કે મજબૂતતા અને વિશિષ્ટતા વચ્ચે કોઈ જરૂરી જોડાણ નથી, કારણ કે આ શોધ પદ્ધતિ દ્વારા ઉત્પાદિત વિસર્જન વળાંક તમામ Tas (ઇન્સેટ) માં સમાન ટોચનું મૂલ્ય દર્શાવે છે.

બીજી તરફ, મજબુતતા પરીક્ષણ વધુ સહનશીલ છે, જે P 6d માં બતાવેલ GFAP પરીક્ષણની જેમ Tas ની વિશાળ શ્રેણીમાં સમાન Cqs ઉત્પન્ન કરે છે.

સમાન 8 ડિગ્રી સેલ્સિયસ રેન્જમાં મેળવેલ Cqs માં તફાવત 1 કરતા ઓછો છે, અને વિસર્જન વળાંક (ઇનસેટ) આ તાપમાન શ્રેણીમાં શોધ લક્ષણોની પુષ્ટિ કરે છે.તે નોંધવું યોગ્ય છે કે ગણતરી કરેલ Tas અને વાસ્તવિક Ta શ્રેણી ખૂબ જ અલગ હોઈ શકે છે.

સંશોધકોને કાર્યક્ષમ પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવામાં મદદ કરવા માટે ઘણી દિશાનિર્દેશો ડિઝાઇન કરવામાં આવી છે, જેમાંથી મોટા ભાગના લાંબા સમયથી સ્થાપિત નિયમો પર આધારિત છે અને પ્રાઇમરના 3′એન્ડ પર ઘણું ધ્યાન આપવામાં આવ્યું છે.ઘણીવાર 3'ના અંતમાં G અથવા C અને બે G અથવા C પાયા (GC ક્લેમ્પ) નો સમાવેશ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, પરંતુ છેલ્લા 5 પાયામાંથી બે કરતાં વધુ નહીં.

વ્યવહારમાં, આ નિયમો સંશોધકોને માર્ગદર્શન આપી શકે છે, પરંતુ તે જરૂરી નથી કે તે તમામ સંજોગોમાં સાચા હોય.

P7 |પ્રાઈમરનો 3′એન્ડ વિશિષ્ટતા અથવા કાર્યક્ષમતા પર ઓછી અસર કરે છે.

A. માનવ HIF-1α (NM_181054.2) જનીન માટે પ્રાઇમર્સની સ્થિતિ.

B. છ પરીક્ષણ વસ્તુઓને વિસ્તૃત કરવા માટે એજિલેન્ટ બ્રિલિયન્ટ III SYBR ગ્રીન મધર લિકર (કેટ. નંબર 600882) નો ઉપયોગ કરો.

C. એમ્પ્લીફિકેશન ગ્રાફ અને બાયો-રેડના CFX qPCR ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ અને 3′એન્ડ પ્રાઇમર્સ દ્વારા રેકોર્ડ કરાયેલ મેલ્ટિંગ કર્વ.NTCs લાલ રંગમાં બતાવવામાં આવે છે.

D. દરેક ટેસ્ટ આઇટમનો Cqs રેકોર્ડ

ઉદાહરણ તરીકે, P 7 માં પરિણામ 3′અંતના નિયમનો વિરોધાભાસ કરે છે.તમામ ડિઝાઇન મૂળભૂત રીતે સમાન પરિણામો આપે છે, જેમાં માત્ર બે પ્રાઈમર સંયોજનો NTC માં બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જાય છે.

જો કે, અમે GC ક્લિપની અસરને સમર્થન આપી શકતા નથી, કારણ કે આ કિસ્સામાં, A અથવા T નો મહત્તમ 30 પાયા તરીકે ઉપયોગ કરવાથી વિશિષ્ટતા ઓછી થતી નથી.

ટેસ્ટ C, જ્યાં F પ્રાઈમર GGCC માં સમાપ્ત થાય છે, NTCs માં Cqs રેકોર્ડ કરે છે, જે દર્શાવે છે કે કોઈ વ્યક્તિ 30-અંતમાં આ સિક્વન્સને ટાળવા માંગે છે.અમે ભારપૂર્વક જણાવીએ છીએ કે પ્રાઈમર જોડીનો શ્રેષ્ઠ 3′અંત ક્રમ નક્કી કરવાનો એકમાત્ર રસ્તો એ છે કે કેટલાક ઉમેદવાર પ્રાઇમર્સનું પ્રાયોગિક ધોરણે મૂલ્યાંકન કરવું.

એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા

અગત્યની રીતે, જો કે બિન-વિશિષ્ટ પીસીઆર શોધ ક્યારેય ચોક્કસ બની શકતી નથી, એન્ઝાઇમ, મધર લિકર, એડિટિવ્સ અને સાયકલિંગ શરતોને બદલીને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને ઘણી અલગ અલગ રીતે એડજસ્ટ અને મહત્તમ કરી શકાય છે.

પીસીઆર શોધની કાર્યક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, લક્ષ્ય ન્યુક્લીક એસિડના 10 અથવા 5 ગણા સીરીયલ ડિલ્યુશનનો ઉપયોગ કરવો શ્રેષ્ઠ છે, એટલે કે, "સ્ટાન્ડર્ડ કર્વ મેથડ".

જો પીસીઆર એમ્પ્લિકોન્સ અથવા સિન્થેટીક ડીએનએ લક્ષ્યોનો ઉપયોગ પ્રમાણભૂત વળાંક પેદા કરવા માટે કરવામાં આવે છે, તો આ લક્ષ્યોના સીરીયલ ડિલ્યુશનને પૃષ્ઠભૂમિ ડીએનએ (જેમ કે જીનોમિક ડીએનએ) ની સતત માત્રા સાથે મિશ્રિત કરવું જોઈએ.

P8 |પીસીઆરની કાર્યક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે મંદન વળાંક.

A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA અને R: TGTCCTGTGTGGTGACTTGTCC અને એજિલેન્ટ્સ બ્રિલિયન્ટ III SYBR ગ્રીન માસ્ટરમિક્સ (કેટલોગ નંબર 600882) PCR અને મેલ્ટિંગ કર્વ સ્થિતિઓ માટે પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરો.

B. 100 ng RNA ને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવામાં આવ્યું હતું, 2 વખત પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, અને સીરીયલ રીતે પાતળું cDNA સેમ્પલ 5 વખત 1 ng માનવ જીનોમિક ડીએનએમાં પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું.ગલન વળાંક ઇનસેટમાં બતાવવામાં આવે છે.

C. બીજા સીડીએનએ નમૂના માટે આરટી પ્રતિક્રિયા, મંદન અને સીરીયલ મંદનનું પુનરાવર્તન કરવામાં આવ્યું હતું, અને પરિણામો સમાન હતા.

P 8 બે પ્રમાણભૂત વળાંકો બતાવે છે, બે અલગ અલગ cDNA નમૂનાઓ પર સમાન શોધ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને, પરિણામ સમાન કાર્યક્ષમતા છે, લગભગ 100%, અને R2 મૂલ્ય પણ સમાન છે, એટલે કે, પ્રાયોગિક ડેટા અને રીગ્રેશન લાઇન અથવા ડેટાની રેખીયતાની ડિગ્રી વચ્ચે ફિટની ડિગ્રી.

બે પ્રમાણભૂત વળાંકો તુલનાત્મક છે, પરંતુ બરાબર સમાન નથી.જો હેતુ લક્ષ્યની ચોક્કસ માત્રા નક્કી કરવાનો હોય, તો એ નોંધવું જોઈએ કે અનિશ્ચિતતાને સમજાવ્યા વિના નકલ નંબરની ગણતરી પ્રદાન કરવી અસ્વીકાર્ય છે.

P9 |પ્રમાણભૂત વળાંકનો ઉપયોગ કરીને પરિમાણ સાથે સંકળાયેલ માપનની અનિશ્ચિતતા.

A. PCR અને ગલન કર્વ સ્થિતિઓ કરવા માટે GAPDH (NM_002046) માટે પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરો.F: ACAGTTGCCATGTAGACC અને R: TAACTGGTTGAGCACAGG અને બાયોલાઇનનું સેન્સિફાસ્ટ SYBR માસ્ટરમિક્સ (કેટલોગ નંબર BIO-98050).

B. એમ્પ્લીફિકેશન ચાર્ટ, મેલ્ટિંગ કર્વ અને સ્ટાન્ડર્ડ કર્વ Bio-Rad ના CFX qPCR ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ સાથે રેકોર્ડ કરેલ છે.

C. સ્ટાન્ડર્ડ કર્વ ગ્રાફ અને 95% કોન્ફિડન્સ ઈન્ટરવલ (CI).

D. મંદન વળાંકમાંથી મેળવેલા ત્રણ Cq મૂલ્યોની નકલ નંબર અને 95% આત્મવિશ્વાસ અંતરાલ.

P 9 બતાવે છે કે ઑપ્ટિમાઇઝ પરીક્ષણ માટે, એક પ્રમાણભૂત વળાંકની સહજ પરિવર્તનશીલતા લગભગ 2 ગણી (95% આત્મવિશ્વાસ અંતરાલ, લઘુત્તમથી મહત્તમ) છે, જે અપેક્ષા રાખી શકાય તેવી સૌથી નાની ચલ હોઈ શકે છે.

સંબંધિત ઉત્પાદન:

સેલ ડાયરેક્ટ RT qPCR કિટ

માઉસ ટેઈલ ડાયરેક્ટ પીસીઆર કીટ

એનિમલ ટિશ્યુ ડાયરેક્ટ પીસીઆર કીટ