RT-qPCR પ્રયોગમાં RNA નિષ્કર્ષણ અને ગુણવત્તા મૂલ્યાંકન, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન અને qPCR ત્રણ પગલાંનો સમાવેશ થાય છે, દરેક પગલામાં ઘણી સાવચેતી હોય છે, અમે નીચે વિગતવાર રજૂ કરીશું.

Ⅰઆરએનએ ગુણવત્તા મૂલ્યાંકન

RT-qPCR પ્રયોગમાં, RNA નિષ્કર્ષણ પૂર્ણ થયા પછી, RNA ની ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવાની જરૂર છે, અને અનુવર્તી પ્રયોગ તે યોગ્યતા પ્રાપ્ત કર્યા પછી જ હાથ ધરવામાં આવી શકે છે.મૂલ્યાંકન પદ્ધતિઓમાં સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર, એજિલેન્ટ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ, એજીલેન્ટ 2100 વિશ્લેષણનો સમાવેશ થાય છે, જેમાંથી સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર અને એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ પદ્ધતિ શોધનો સમાવેશ થાય છે.એ નોંધવું જોઈએ કે આરએનએ એકાગ્રતા, શુદ્ધતા અને અખંડિતતાની તપાસ અને વિશ્લેષણ પૂર્ણ કરવા માટે આ બે પદ્ધતિઓનો એકસાથે ઉપયોગ કરવાની જરૂર છે, જેથી RNAની ગુણવત્તા સુનિશ્ચિત કરી શકાય.

સંબંધિત આરએનએ આઇસોલેશન કીટ: 

સેલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ

ઉચ્ચ શુદ્ધ અને ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા કુલ આરએનએ વિવિધ સંસ્કારી કોષોમાંથી 11 મિનિટમાં મેળવી શકાય છે.

એનિમલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કિટ

વિવિધ પ્રાણીઓના પેશીઓમાંથી ઝડપથી અને અસરકારક રીતે ઉચ્ચ-શુદ્ધતા અને ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા કુલ આરએનએ કાઢો.

સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટર:

સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે આરએનએની સાંદ્રતા અને શુદ્ધતા નક્કી કરવા માટે થાય છે, પરંતુ તે આરએનએ અને જીનોમિક અવશેષોની અખંડિતતાને શોધી શકતું નથી.તેમાંથી, A260/280 અને A260/230 એ આરએનએ શુદ્ધતા શોધ માટેના મહત્વપૂર્ણ પરિમાણો છે, અને આરએનએ શુદ્ધતા તેમના મૂલ્યોની વધઘટ અનુસાર શોધી શકાય છે:

1. 1.9< A260/280< 2.1, સૂચવે છે કે RNA શુદ્ધતા સારી છે;A260/280<1.9, સૂચવે છે કે RNA માં પ્રોટીન અવશેષો હોઈ શકે છે;A260/280>2.1, RNA ના સંભવિત આંશિક અધોગતિને દર્શાવે છે, જે એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા વધુ પુષ્ટિ કરી શકાય છે.

2. 2.0< A260/230< 2.2, સૂચવે છે કે RNA શુદ્ધતા સારી છે;A260/230< 2.0, જે દર્શાવે છે કે RNA માં કાર્બનિક રીએજન્ટના અવશેષો હોઈ શકે છે, જેમ કે ફિનોલ્સ, ઇથેનોલ અથવા શર્કરા.

એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ:

એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ એસે આરએનએ અખંડિતતા, જીનોમ અને પ્રોટીન અવશેષોનું વિશ્લેષણ કરી શકે છે, પરંતુ આરએનએની સાંદ્રતાને ચોક્કસ રીતે માપી શકતું નથી અથવા કાર્બનિક રીએજન્ટ્સના અવશેષોને શોધી શકતું નથી.ઉદાહરણ તરીકે યુકેરીયોટિક આરએનએ ટેમ્પલેટ લો:

1. આરએનએ એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસને આધિન હતું.જો જેલ મેપ પર 28sRNA, 18sRNA અને 5.8sRNA ના માત્ર ત્રણ સિંગલ બેન્ડ હોય, તો તે દર્શાવે છે કે કાઢવામાં આવેલ RNA અકબંધ છે.જો કોઈ ખેંચવાની ઘટના હોય, તો તે આરએનએના આંશિક અધોગતિને સૂચવે છે.

2. જો ગુંદરના છિદ્ર અને 28sRNA બેન્ડ વચ્ચે એક જ તેજસ્વી બેન્ડ હોય, તો ત્યાં જીનોમિક ડીએનએ અવશેષો હોઈ શકે છે.

3. જો ગુંદરના છિદ્રમાં બેન્ડ્સ દેખાય છે, તો તે સૂચવે છે કે પ્રોટીન અને અન્ય મેક્રોમોલેક્યુલર પદાર્થોના અવશેષો હોઈ શકે છે.

Ⅱ. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન

આરએનએ નિષ્કર્ષણ પૂર્ણ થયા પછી, તેને અનુગામી પ્રયોગો માટે સીડીએનએમાં ઉલટાવી દેવાની જરૂર છે, તેથી રિવર્સલ પગલું આવશ્યક છે.રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને પ્રાઈમરની પસંદગીમાંથી રજૂ કરવામાં આવશે:

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ પસંદગી:

લાક્ષણિક રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસમાં AMV RTase અને MMLV RTase નો સમાવેશ થાય છે.AMV RTase ના RNase H માં મજબૂત પ્રવૃત્તિ, ટૂંકી સંશ્લેષણ લંબાઈ, ઓછી સંશ્લેષણ રકમ અને સારી થર્મલ સ્થિરતા (42 ~ 55℃) છે.MMLV RTase ની RNase H પ્રવૃત્તિ નબળી છે, સંશ્લેષણ લંબાઈ લાંબી છે, સંશ્લેષણનું પ્રમાણ વધારે છે, અને થર્મલ સ્થિરતા નબળી છે (37 ~ 42℃).

કારણ કે RNase H એન્ઝાઇમ RNA ટેમ્પ્લેટને અધોગતિનું કાર્ય ધરાવે છે, નબળા RNase H પ્રવૃત્તિ સાથે MMLV ને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન દરમિયાન પ્રાધાન્યપૂર્વક પસંદ કરવું જોઈએ, અને બાદમાં આનુવંશિક ઇજનેરી પછી, MMLV ની થર્મલ સ્થિરતા ગુણાત્મક લીપ પર પહોંચી ગઈ છે.ફોરજીન લેવુંફોરેસી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ (વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે M-MLV) ઉદાહરણ તરીકે, તે આનુવંશિક પુનઃસંયોજન તકનીકનો ઉપયોગ કરીને ઇ. કોલી એન્જિનિયર્ડ બેક્ટેરિયામાં વ્યક્ત કરાયેલ એક નવી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ છે.તે રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ પોલિમરેઝ છે જે સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ આરએનએ, ડીએનએ અથવા આરએનએ:ડીએનએ હાઇબ્રિડમાંથી પૂરક ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરે છે.તેમાં RNase H પ્રવૃત્તિ, મજબૂત સ્થિરતા, મજબૂત RNA એફિનિટી અને ઉચ્ચ તપાસ સંવેદનશીલતા નથી.

 

ફોરેસી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ (વિપરીત ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે M-MLV)

પ્રાઈમરની પસંદગી:

સામાન્ય રીતે RT પ્રાઇમર્સ ત્રણ કેટેગરીમાં આવે છે: ઓલિગો ડીટી, રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ અને જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ.વિવિધ પ્રાયોગિક જરૂરિયાતો અનુસાર ઉપયોગ માટે યોગ્ય પ્રાઇમર્સ પસંદ કરો.

1. જો ટેમ્પ્લેટ યુકેરીયોટિક મૂળનો હોય અને અંતમાં સીડીએનએ નિયમિત પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન માટે વપરાય છે, તો ઓલિગો (ડીટી) ની ભલામણ કરવામાં આવે છે;જો અનુગામી પ્રયોગનો ઉપયોગ માત્ર qPCR માટે કરવામાં આવે છે, તો રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનની કાર્યક્ષમતા વધારવા માટે ઓલિગો (dT) ને રેન્ડમ પ્રાઈમર સાથે મિશ્રિત કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

2. જો ટેમ્પલેટ પ્રોકેરીયોટ્સમાંથી હોય, તો રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન માટે રેન્ડમ પ્રાઇમર્સ અથવા જનીન વિશિષ્ટ પ્રાઇમર્સ પસંદ કરવા જોઈએ.

Ⅲ.qPCR

ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિફિકેશન મુખ્યત્વે માત્રાત્મક પદ્ધતિઓ, પ્રાઈમર ડિઝાઇન સિદ્ધાંતો, ROX પસંદગી, પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ રૂપરેખાંકન અને પ્રતિક્રિયા સ્થિતિ સેટિંગ વગેરેની પસંદગીમાંથી વિસ્તૃત થાય છે.

માત્રાત્મક પદ્ધતિઓની પસંદગી:

જથ્થાત્મક પદ્ધતિઓ સંબંધિત જથ્થાત્મક પદ્ધતિઓ અને સંપૂર્ણ માત્રાત્મક પદ્ધતિઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે.સાપેક્ષ પ્રમાણીકરણનો ઉપયોગ જનીન અભિવ્યક્તિ પર અમુક સારવાર પદ્ધતિઓની અસર શોધવા, જુદા જુદા સમયે જનીન અભિવ્યક્તિના તફાવતને શોધવા અને વિવિધ પેશીઓમાં જનીન અભિવ્યક્તિના તફાવતની તુલના કરવા માટે થઈ શકે છે.સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ વાયરસમાં ન્યુક્લીક એસિડનું પ્રમાણ શોધી શકે છે અને તેથી વધુ.પ્રયોગો કરતી વખતે, આપણે આપણા પોતાના પ્રયોગો અનુસાર યોગ્ય જથ્થાત્મક પદ્ધતિઓ પસંદ કરવી જોઈએ.

પ્રાઈમર ડિઝાઇન સિદ્ધાંતો:

qPCR માટે પ્રાઈમરની ડિઝાઇન એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને ઉત્પાદનની વિશિષ્ટતા સાથે સીધી રીતે સંબંધિત છે.તેથી, સારા પ્રાઇમરને યોગ્ય રીતે ડિઝાઇન કરવું એ સફળ qPCRનું પ્રથમ પગલું છે.પ્રાઇમરની ડિઝાઇનમાં, પરંપરાગત પ્રાઇમર ડિઝાઇનના સિદ્ધાંતને પૂર્ણ કરતી વખતે નીચેના સિદ્ધાંતો પર ધ્યાન આપવું જોઈએ:

1. લક્ષ્ય ટુકડાની લંબાઈ 100 અને 300 bp વચ્ચે નિયંત્રિત થાય છે;

2. જીનોમિક ડીએનએના પ્રભાવને ટાળવા માટે ક્રોસ-એક્સોન ડિઝાઇન;

3. એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા માટે ડિઝાઇન કરેલ પ્રાઇમર્સનું પરીક્ષણ કરવાની જરૂર છે, અને જ્યારે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા ધોરણ (90-110%) સુધી પહોંચે ત્યારે જ તેઓ માત્રાત્મક પ્રયોગો માટે વાપરી શકાય છે;

4. પ્રાઈમર સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે 0.1uM અને 1.0uM વચ્ચે ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવે છે.

ની પસંદગીROX:

જથ્થાત્મક પ્રતિક્રિયાની પ્રક્રિયામાં, ROX ઓપ્ટિકલ પાથ તફાવત, પાઇપિંગ ભૂલ અથવા બાષ્પીભવન અને ઘનીકરણને કારણે વોલ્યુમ તફાવતને એકસરખી રીતે સમાયોજિત કરી શકે છે, પરિણામોની પુનરાવર્તિતતાને સુધારી શકે છે.જો કે, એ નોંધવું જોઈએ કે ROX ની પસંદગી સાધન સાથે સંબંધિત છે.જો qPCR ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટમાં છિદ્રો વચ્ચેના તફાવતને આપમેળે સુધારવાનું કાર્ય હોય, તો તેને ROX ઉમેરવાની જરૂર નથી;અન્યથા, તેને ROX કરેક્શન ઉમેરવાની જરૂર છે.રીએજન્ટ ખરીદવામાં નાના ભાગીદારો યોગ્ય ROX પસંદ કરવા માટે વપરાતા સાધન અનુસાર હોવા જોઈએ, પછીની ભૂલો ટાળો.

પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની તૈયારી:

20ul અને 50ul ની પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમ પસંદ કરવામાં આવે છે.જ્યારે સિસ્ટમ ઘડવામાં આવે ત્યારે નીચેની બાબતો પર ધ્યાન આપવું જોઈએ:

1. અતિ-સ્વચ્છ વર્કબેન્ચમાં વેન્ટિલેશન દ્વારા પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ તૈયાર કરવાની જરૂર છે, નવી ડીડીએચ₂O નો ઉપયોગ દરેક પ્રયોગ માટે થાય છે;

2. દરેક પ્રયોગને સિસ્ટમમાં પ્રદૂષણ છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે NTC તૈયાર કરવાની જરૂર છે, અને સિસ્ટમ તૈયાર કરતી વખતે પ્રાઇમરની દરેક જોડીએ NTC કરવાની જરૂર છે;

3. આરએનએ ટેમ્પલેટમાં જીડીએનએ અવશેષો છે કે કેમ તે શોધવા માટે, દરેક નમૂના માટે તપાસ માટે એનઆરટી તૈયાર કરી શકાય છે;

4. સિસ્ટમ તૈયાર કરતી વખતે, એક નમૂના માટે ઓછામાં ઓછા 3 તકનીકી પુનરાવર્તનો કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે;

5. જ્યારે ટેમ્પલેટ cDNA હોય, ત્યારે qPCR પ્રયોગ પર રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન સિસ્ટમની અવરોધક અસરને ઘટાડવા માટે તેને 5-10 વખત પાતળું કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.ઢાળ દ્વારા નમૂનાના જથ્થાનું અન્વેષણ કરવું વધુ સારું છે, જેથી CT મૂલ્ય 20-30 ની વચ્ચે આવે;

6. પ્રતિક્રિયાઓની આવશ્યક સંખ્યા નક્કી કરો, પ્રતિક્રિયાઓની સંખ્યાના આધારે 5-10% વધારો, અને વોલ્યુમ કન્ફિગરેશન નંબરની ગણતરી કરો;

7, સિસ્ટમ પ્રિમિક્સ સિદ્ધાંતનો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવે છે, સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી મિશ્રણ કરવામાં આવે છે અને ખાતરી કરો કે કોઈ પરપોટા નથી;

8, શક્ય હોય ત્યાં સુધી સહાયક ઉપભોક્તા પસંદ કરવા.

સંબંધિત RT-qPCR કિટ