તે જાણીતું છે કે કેન્દ્રીય સિદ્ધાંતમાં, RNA એ DNA અને પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ વચ્ચે ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ મધ્યસ્થી છે.ડીએનએની શોધની તુલનામાં, આરએનએની શોધ સજીવોમાં જનીન અભિવ્યક્તિને વધુ ઉદ્દેશ્યથી પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.RNA ને સંડોવતા પ્રયોગોમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છે: qRT-PCR, RNA-Seq, અને ફ્યુઝન જનીન શોધ, વગેરે. RNA ની જ લાક્ષણિકતાઓના આધારે (RNA ની સુગર રિંગમાં DNA ની સુગર રિંગ કરતાં વધુ એક મુક્ત હાઇડ્રોક્સિલ જૂથ હોય છે), પર્યાવરણમાં મોટી સંખ્યામાં RNases સાથે, RNA વધુ અસ્થિર છે અને DNA કરતાં વધુ સરળ છે.કચરો અંદર, કચરો બહાર, જો RNA ની ગુણવત્તા સારી ન હોય, તો પ્રાયોગિક પરિણામો અસંતોષકારક હોવા જોઈએ, ખાસ કરીને અચોક્કસ ડેટા અથવા નબળી પુનરાવર્તિતતા તરીકે પ્રગટ થાય છે.તેથી, આરએનએની પ્રક્રિયા પર વધુ ધ્યાન આપવું જોઈએ, અને અનુગામી પ્રાયોગિક ડેટાની ચોકસાઈ અને ચોકસાઈની ખાતરી કરવા માટે ગુણવત્તા નિયંત્રણની લિંક પણ વધુ મહત્વપૂર્ણ છે.

આરએનએના ગુણવત્તા નિયંત્રણ માટે, સામાન્ય રીતે નીચેની સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિઓ છે:

• સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રી
• એગ્રોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ
• Agilent Bioanalyzer
• રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR
• ક્યુબિટ ફ્લોરોસન્ટ ડાય પદ્ધતિ

01 સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રી

આરએનએ સંયોજિત ડબલ બોન્ડ ધરાવે છે અને 260nm ની તરંગલંબાઇ પર શોષણની ટોચ ધરાવે છે.લેમ્બર્ટ-બીયરના કાયદા અનુસાર, અમે શોષણની ટોચ પરથી 260nm પર RNA સાંદ્રતાની ગણતરી કરી શકીએ છીએ.વધુમાં, અમે 260nm, 280nm અને 230nm શોષણ શિખરોના ગુણોત્તર અનુસાર RNA ની શુદ્ધતાની પણ ગણતરી કરી શકીએ છીએ.280nm અને 230nm અનુક્રમે પ્રોટીન અને નાના અણુઓના શોષણના શિખરો છે.A260/A280 અને A260/A230 નો ગુણોત્તર લાયક RNA શુદ્ધતા 2 કરતા વધારે હોવો જોઈએ. જો તે 2 કરતા ઓછો હોય, તો તેનો અર્થ એ કે RNA નમૂનામાં પ્રોટીન અથવા નાના પરમાણુ દૂષણ છે અને તેને ફરીથી શુદ્ધ કરવાની જરૂર છે.દૂષિત સ્ત્રોતો ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રયોગોને અસર કરશે, જેમ કે પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અવરોધે છે, જેના પરિણામે અચોક્કસ જથ્થાત્મક પરિણામો આવે છે.આરએનએની શુદ્ધતા અનુગામી પરિણામો પર ખૂબ પ્રભાવ ધરાવે છે, તેથી સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રી સામાન્ય રીતે ન્યુક્લીક એસિડ પ્રયોગોના પ્રથમ પગલામાં એક અનિવાર્ય ગુણવત્તા નિયંત્રણ કડી છે.

આકૃતિ 1. લાક્ષણિક RNA/DNA શોષણ સ્પેક્ટ્રમ

02 એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ

શુદ્ધતા ઉપરાંત, આરએનએની અખંડિતતા પણ આરએનએની ગુણવત્તા નક્કી કરવા માટેનું એક મહત્વનું સૂચક છે.આરએનએનું અધોગતિ નમૂનામાં મોટી સંખ્યામાં ટૂંકા ટુકડાઓ તરફ દોરી જશે, તેથી સંદર્ભ ક્રમ દ્વારા અસરકારક રીતે શોધી અને આવરી શકાય તેવા આરએનએ ટુકડાઓની સંખ્યામાં ઘટાડો થશે.RNA અખંડિતતા 1% એગેરોઝ જેલ પર કુલ RNA ના ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દ્વારા ચકાસી શકાય છે.આ પદ્ધતિ જેલને જાતે ગોઠવી શકે છે અથવા અખંડિતતા પરીક્ષણ માટે પ્રિફેબ્રિકેટેડ E-Jel™ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરી શકે છે.કુલ RNA ના 80% થી વધુ રિબોસોમલ RNA છે, જેમાંથી મોટા ભાગના 28S અને 18S rRNA (સસ્તન પ્રણાલીઓમાં) બનેલા છે.સારી ગુણવત્તાની RNA બે સ્પષ્ટ તેજસ્વી બાર બતાવશે, જે અનુક્રમે 28S અને 18S તેજસ્વી બાર છે, 5 Kb અને 2 Kb પર, અને ગુણોત્તર 2:1 ની નજીક હશે.જો તે પ્રસરેલી સ્થિતિમાં હોય, તો તેનો અર્થ એ છે કે આરએનએનો નમૂનો બગડ્યો હોઈ શકે છે, અને આરએનએની ગુણવત્તાને વધુ ચકાસવા માટે પછીથી વર્ણવેલ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

આકૃતિ 2. એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ પર ડીગ્રેડેડ (લેન 2) અને અખંડ આરએનએ (લેન 3) ની સરખામણી

03 એજિલેન્ટ બાયોએનાલાઈઝર

ઉપર વર્ણવેલ એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ પદ્ધતિ ઉપરાંત, જે અમને RNA ની અખંડિતતાને સરળ અને ઝડપથી ઓળખવામાં મદદ કરી શકે છે, અમે RNA ની અખંડિતતા નક્કી કરવા માટે Agilent bioanalyzer નો પણ ઉપયોગ કરી શકીએ છીએ.તે RNA સાંદ્રતા અને અખંડિતતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે માઇક્રોફ્લુઇડિક્સ, કેશિલરી ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ અને ફ્લોરોસેન્સના સંયોજનનો ઉપયોગ કરે છે.આરએનએ નમૂનાની પ્રોફાઇલનું વિશ્લેષણ કરવા માટે બિલ્ટ-ઇન અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને, એજિલેન્ટ બાયોએનાલાઇઝર સંદર્ભ RNA અખંડિતતા મૂલ્ય, RNA અખંડિતતા નંબર (ત્યારબાદ RIN તરીકે ઓળખાય છે) [1]ની ગણતરી કરી શકે છે.RIN નું મૂલ્ય જેટલું મોટું છે, RNA ની અખંડિતતા વધારે છે (1 અત્યંત અધોગતિ છે, 10 સૌથી સંપૂર્ણ છે).RNA સાથે સંકળાયેલા કેટલાક પ્રયોગો ગુણવત્તા મૂલ્યાંકન માટે પરિમાણ તરીકે RIN નો ઉપયોગ સૂચવે છે.ઉદાહરણ તરીકે ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ પ્રયોગો (ત્યારબાદ NGS તરીકે ઓળખવામાં આવે છે) લેતા, Oncomine™ Human Immune Repertoire ની માર્ગદર્શિકા, જેનો ઉપયોગ થર્મો ફિશરની Oncomine પેનલ શ્રેણીમાં B સેલ અને T સેલ એન્ટિજેન રીસેપ્ટર્સને શોધવા માટે કરવામાં આવે છે, સૂચવે છે કે RIN મૂલ્યો ધરાવતા નમૂનાઓ 4,3, એફ (3, એફ) કરતાં વધુ અસરકારક રીતે વાંચી શકાય છે.અલગ-અલગ પૅનલ માટે અલગ-અલગ ભલામણ કરેલ રેન્જ છે અને ઘણી વખત ઉચ્ચ RIN વધુ અસરકારક ડેટા લાવી શકે છે.

આકૃતિ 3, Oncomine™ માનવ રોગપ્રતિકારક ભંડાર પ્રયોગોમાં, 4 થી વધુ RIN સાથેના નમૂનાઓ વધુ અસરકારક રીડ અને T સેલ ક્લોન્સ શોધી શકે છે.【2】

જો કે, RIN મૂલ્યની પણ કેટલીક મર્યાદાઓ છે.જોકે RIN નો NGS પ્રાયોગિક ડેટાની ગુણવત્તા સાથે ઉચ્ચ સહસંબંધ છે, તે FFPE નમૂનાઓ માટે યોગ્ય નથી.FFPE નમૂનાઓ લાંબા સમયથી રાસાયણિક રીતે સારવાર કરવામાં આવે છે, અને કાઢવામાં આવેલ RNA સામાન્ય રીતે પ્રમાણમાં ઓછું RIN મૂલ્ય ધરાવે છે.જો કે, આનો અર્થ એ નથી કે પ્રયોગનો અસરકારક ડેટા અસંતોષકારક હોવો જોઈએ.FFPE નમૂનાઓની ગુણવત્તાનું ચોક્કસ મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમારે RIN સિવાયના માપનો ઉપયોગ કરવાની જરૂર છે.RIN ઉપરાંત, Agilent bioanalyzer પણ RNA ગુણવત્તાના મૂલ્યાંકન પરિમાણ તરીકે DV200 મૂલ્યની ગણતરી કરી શકે છે.DV200 એ એક પરિમાણ છે જે RNA નમૂનામાં 200 bp કરતા મોટા ટુકડાઓના પ્રમાણની ગણતરી કરે છે.DV200 એ RIN કરતાં FFPE નમૂનાની ગુણવત્તાનું વધુ સારું સૂચક છે.FFPE દ્વારા કાઢવામાં આવેલા RNA માટે, તે અસરકારક રીતે શોધી શકાય તેવા જનીનોની સંખ્યા અને જનીનોની વિવિધતા [3] સાથે ખૂબ જ ઉચ્ચ સંબંધ ધરાવે છે.જો કે DV200 FFPE ની ગુણવત્તા શોધમાં ખામીઓ પૂરી કરી શકે છે, તેમ છતાં એજિલેન્ટ બાયોએનાલાઈઝર હજુ પણ RNA નમૂનાઓમાં ગુણવત્તા સમસ્યાઓનું વ્યાપકપણે વિશ્લેષણ કરી શકતું નથી, જેમાં નમૂનાઓમાં અવરોધકો છે કે કેમ તે સહિત.અવરોધકો પોતે ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રયોગોની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અસર કરી શકે છે અને ઉપયોગી ડેટાની માત્રા ઘટાડી શકે છે.નમૂનામાં અવરોધક છે કે કેમ તે જાણવા માટે, અમે આગળ વર્ણવેલ રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR પદ્ધતિ અપનાવી શકીએ છીએ.

04 રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR

રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR પદ્ધતિ માત્ર નમૂનામાં અવરોધકોને શોધી શકતી નથી, પરંતુ FFPE નમૂનામાં RNA ની ગુણવત્તાને પણ ચોક્કસ રીતે પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.એજિલેન્ટ જૈવિક વિશ્લેષકોની તુલનામાં, રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક સાધનો તેમના વ્યાપક ઉપયોગને કારણે મુખ્ય જૈવિક પ્રયોગશાળાઓમાં વધુ લોકપ્રિય છે.RNA નમૂનાઓની ગુણવત્તા ચકાસવા માટે, અમારે માત્ર GUSB (Cat no. Hs00939627) જેવા આંતરિક સંદર્ભ જનીનો માટે પ્રાઈમર પ્રોબ ખરીદવા અથવા તૈયાર કરવાની જરૂર છે.સંપૂર્ણ માત્રાત્મક પ્રયોગો કરવા માટે પ્રાઇમર્સ, પ્રોબ્સ અને ધોરણો (જાણીતી સાંદ્રતાના કુલ આરએનએ) ના આ સમૂહનો ઉપયોગ કરીને, અસરકારક આરએનએ ફ્રેગમેન્ટ સાંદ્રતાની ગણતરી આરએનએ ગુણવત્તા (ટૂંકમાં કાર્યાત્મક આરએનએ ક્વોન્ટિટેશન (એફઆરક્યુ) ના મૂલ્યાંકન ધોરણ તરીકે કરી શકાય છે.NGS પરીક્ષણમાં, અમે જોયું કે RNA નમૂનાઓના FRQ અસરકારક ડેટા વોલ્યુમ સાથે ખૂબ જ ઉચ્ચ સંબંધ ધરાવે છે.0.2ng/uL FRQ કરતા વધારે બધા નમૂનાઓ માટે, ઓછામાં ઓછા 70% રીડ અસરકારક રીતે સંદર્ભ ક્રમને આવરી શકે છે (આકૃતિ 4).

આકૃતિ 4, ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક પદ્ધતિ દ્વારા શોધાયેલ FRQ મૂલ્ય NGS પ્રયોગમાં મેળવેલા અસરકારક ડેટા સાથે ખૂબ જ ઉચ્ચ સહસંબંધ (R2>0.9) ધરાવે છે.લાલ રેખા એ 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) ની બરાબર FRQ મૂલ્ય છે.【4】

FFPE નમૂનાઓ પર લાગુ થવા ઉપરાંત, વાસ્તવિક સમયની જથ્થાત્મક PCR પદ્ધતિ પણ અસરકારક રીતે નમૂનાઓમાં અવરોધકોનું નિરીક્ષણ કરી શકે છે.અમે ઇન્ટરનલ પોઝિટિવ કંટ્રોલ (IPC) અને તેની તપાસ સાથે પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમમાં શોધી શકાય તેવો નમૂનો ઉમેરી શકીએ છીએ, અને પછી Ct મૂલ્ય મેળવવા માટે ફ્લોરોસેન્સ પ્રમાણીકરણ કરી શકીએ છીએ.જો Ct મૂલ્ય નો-સેમ્પલ પ્રતિક્રિયામાં Ct મૂલ્ય કરતાં પાછળ રહે છે, તો તે સૂચવે છે કે અવરોધક નમૂનામાં હાજર છે અને પ્રતિક્રિયામાં એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અટકાવે છે.

05 ક્યુબીટ ફ્લોરોસન્ટ ડાય પદ્ધતિ

ક્યુબીટ ફ્લોરોમીટર એ ન્યુક્લીક એસિડની સાંદ્રતા અને શુદ્ધતા શોધવા માટે સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતું નાનું ઉપકરણ છે, જે ચલાવવામાં સરળ છે અને લગભગ દરેક મોલેક્યુલર બાયોલોજી લેબોરેટરીમાં અસ્તિત્વ ધરાવે છે.તે શોધીને અને ન્યુક્લીક એસિડ-બંધનકર્તા ફ્લોરોસન્ટ ડાય (ક્યુબિટ ડિટેક્શન રીએજન્ટ) દ્વારા ન્યુક્લિક એસિડની સાંદ્રતાની ચોક્કસ ગણતરી કરે છે.ક્યુબિટમાં ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા છે, અને તે આરએનએને pg/µL સાંદ્રતા સુધી સચોટ રીતે માપી શકે છે.ન્યુક્લીક એસિડની સાંદ્રતાને ચોક્કસ રીતે માપવાની જાણીતી ક્ષમતા ઉપરાંત, થર્મો ફિશરનું નવીનતમ નવું મોડલ, ક્યુબીટ 4.0, આરએનએની અખંડિતતાને પણ શોધી શકે છે.Qubit 4.0′s RNA ડિટેક્શન સિસ્ટમ (RNA IQ Assay) એક સાથે બે ચોક્કસ ફ્લોરોસન્ટ રંગો શોધીને RNA ની અખંડિતતા શોધે છે.આ બે ફ્લોરોસન્ટ રંગો અનુક્રમે મોટા ટુકડાઓ અને RNA ના નાના ટુકડાઓ સાથે જોડાઈ શકે છે.આ બે ફ્લોરોસન્ટ રંગો નમૂનામાં આરએનએના મોટા ટુકડાઓનું પ્રમાણ દર્શાવે છે અને તેમાંથી આરએનએ ગુણવત્તાનું પ્રતિનિધિત્વ કરતી IQ (અખંડિતતા અને ગુણવત્તા) મૂલ્યની ગણતરી કરી શકાય છે.IQ મૂલ્ય FFPE અને બિન-FFPE નમૂનાઓ બંનેને લાગુ પડે છે, અને અનુગામી ક્રમની ગુણવત્તા પર ઘણો પ્રભાવ ધરાવે છે.NGS પ્રયોગોને ઉદાહરણ તરીકે લેતા, Ion torrent™ પ્લેટફોર્મ પર કરવામાં આવેલા RNA-Seq પરીક્ષણ પ્રયોગોમાં, 4 કરતા વધુ IQ મૂલ્યો ધરાવતા મોટાભાગના નમૂનાઓ ઓછામાં ઓછા 50% અસરકારક વાંચન ધરાવતા હતા (આકૃતિ 5).ઉપર જણાવેલી શોધ પદ્ધતિઓની તુલનામાં, Qubit IQ Assay માત્ર ચલાવવા માટે વધુ અનુકૂળ નથી અને ઓછો સમય લે છે (પાંચ મિનિટની અંદર), પરંતુ માપેલ પરિમાણ IQ મૂલ્ય અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રયોગોની ડેટા ગુણવત્તા વચ્ચે પણ સારો સંબંધ છે.

આકૃતિ 5, Qubit RNA IQ મૂલ્ય અને RNA-Seq ના મેપ કરેલ રીડ વચ્ચે એક મહાન સંબંધ છે.【5】

ઉપરોક્ત પરિચય દ્વારા, હું માનું છું કે દરેકને વિવિધ RNA ગુણવત્તા નિયંત્રણ પદ્ધતિઓની પૂરતી સમજ છે.વ્યવહારમાં, તમે પસંદ કરી શકો છોનમૂનાના પ્રકાર અને હાલના સાધનો અનુસાર અનુરૂપ પદ્ધતિ.માત્ર આરએનએની ગુણવત્તાને સારી રીતે નિયંત્રિત કરીને આપણે નબળા નમૂનાની ગુણવત્તાને કારણે આવતા પ્રયોગોની નિષ્ફળતાને ટાળી શકીએ છીએ, આમ કિંમતી સમય, ઊર્જા અને ખર્ચ બચાવી શકીએ છીએ.

સંદર્ભ ઉત્પાદનો:

એનિમલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કિટ

સેલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ

સંદર્ભ

【1】શ્રોડર, એ., મુલર, ઓ., સ્ટોકર, એસ. એટ અલ.RIN: RNA માપને અખંડિતતા મૂલ્યો સોંપવા માટે RNA અખંડિતતા નંબર.BMC મોલેક્યુલર બાયોલ 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ઓનકોમિન હ્યુમન ઇમ્યુન રેપર્ટોયર વપરાશકર્તા માર્ગદર્શિકા (પબ. નંબર MAN0017438 રેવ. C.0).

【3】લેહ સી વેહમાસ, ચાર્લ્સ ઇ વૂડ, બ્રાયન એન ચોર્લી, કેરોલ એલ યૌક, ગેઇલ એમ નેલ્સન, સુસાન ડી હેસ્ટર, આર્કાઇવલ ફોર્મલિન-ફિક્સ્ડ પેરાફિન-એમ્બેડેડ ટીશ્યુ સેમ્પલ્સ, વોલ્યુમોલોજીકલ ઇઝ20, પેજ 201, ટોક્સીકોલોજિકલ સાયન્સ 201 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/