પીપેટ ટીપ્સ અને ઇપી ટ્યુબ વગેરેનું વંધ્યીકરણ.

1. ડીયોનાઇઝ્ડ પાણી સાથે 0.1% (એક હજારમો) DEPC (અત્યંત ઝેરી પદાર્થ) તૈયાર કરો, તેનો ઉપયોગ ફ્યુમ હૂડમાં કાળજીપૂર્વક કરો, અને તેને પ્રકાશથી 4°C પર સંગ્રહિત કરો;

DEPC પાણી એ શુદ્ધ પાણી છે જેને DEPC વડે સારવાર આપવામાં આવે છે અને ઉચ્ચ તાપમાન અને ઉચ્ચ દબાણ દ્વારા વંધ્યીકૃત કરવામાં આવે છે.RNase, DNase અને પ્રોટીનનેઝ મુક્ત હોવાનું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું.

2. પાઈપેટ ટીપ અને EP ટ્યુબને 0.1% DEPC માં નાખો અને ખાતરી કરો કે પાઈપેટ ટીપ અને EP ટ્યુબ 0.1% DEP થી ભરેલી છે.

3. પ્રકાશથી બચાવો, ઊભા રહેવા દો, રાતોરાત (12-24 કલાક)

4. ટીપ અને EP ટ્યુબ ધરાવતા બોક્સને DEPC માં પલાળી રાખવાની જરૂર નથી.ટીપ અથવા EP ટ્યુબમાં DEPC પાણીને લગભગ દૂર કર્યા પછી, તેને પેક કરો અને તેને લપેટી લો.

5. 121 ડિગ્રી સેલ્સિયસ, 30 મિનિટ

6. 180 ડિગ્રી સેલ્સિયસ, કેટલાક કલાકો સુધી સૂકું (ઓછામાં ઓછા 3 કલાક)

નોંધ: એ.DEPC ને હેન્ડલ કરતી વખતે લેટેક્સ ગ્લોવ્ઝ અને માસ્ક પહેરો!b, અથવા DEPC વંધ્યીકરણ વિના, 130 ℃, 90 મિનિટ ઓટોક્લેવ (ઘણી પ્રયોગશાળાઓ ઉચ્ચ તાપમાન બે વાર વંધ્યીકરણ)

આરએનએ નિષ્કર્ષણ વિચારણાઓ

ટીશ્યુ આરએનએ આઇસોલેશન નિષ્ફળતાની બે મુખ્ય ઘટના

આરએનએ અધોગતિ અને પેશીઓમાં અશુદ્ધિઓના અવશેષો,અધોગતિના સંદર્ભમાં, ચાલો પહેલા જોઈએ કે શા માટે સંસ્કારી કોષોમાંથી કાઢવામાં આવેલ આરએનએ સરળતાથી ડિગ્રેડેશન નથી થતું.હાલના RNA નિષ્કર્ષણ રીએજન્ટમાં એવા ઘટકો હોય છે જે ઝડપથી RNase ને અટકાવે છે.સંવર્ધિત કોષોમાં લાયસેટ ઉમેરો, અને તેને સરળ રીતે ભળી દો, બધા કોષો લાયસેટ સાથે સારી રીતે મિશ્રિત થઈ શકે છે, અને કોષો સંપૂર્ણપણે લીસેટ થઈ જાય છે.કોષો લિઝ્ડ થયા પછી, લિસેટમાં સક્રિય ઘટકો તરત જ અંતઃકોશિક RNase ને અવરોધે છે, તેથી RNA અકબંધ રહે છે.કહેવાનો અર્થ એ છે કે, કારણ કે સંસ્કારી કોષો લિસેટ સાથે સરળતાથી અને સંપૂર્ણ રીતે સંપર્કમાં આવે છે, તેમના આરએનએ સરળતાથી ડિગ્રેડ થતા નથી;બીજી બાજુ, પેશીઓમાં આરએનએ સરળતાથી અધોગતિ પામે છે કારણ કે પેશીના કોષો લાઇસેટ સાથે ઝડપથી સંપર્ક કરવા માટે સરળ નથી.પૂરતા સંપર્કને કારણે.તેથી,આરએનએ પ્રવૃત્તિને અટકાવતી વખતે પેશીને એક કોષમાં ફેરવવાનો માર્ગ છે એમ ધારીને, અધોગતિની સમસ્યા સંપૂર્ણપણે હલ થઈ શકે છે.

લિક્વિડ નાઇટ્રોજન મિલિંગ એ આવી સૌથી અસરકારક પદ્ધતિ છે.જો કે, પ્રવાહી નાઇટ્રોજન મિલિંગ પદ્ધતિ ખૂબ જ મુશ્કેલીકારક છે, ખાસ કરીને જ્યારે નમૂનાઓની સંખ્યા મોટી હોય.આનાથી આગલી શ્રેષ્ઠ વસ્તુનો જન્મ થયો: હોમોજેનાઇઝર.આhomogenizerકોશિકાઓ લાયસેટ સાથે સંપર્ક કરે તે પહેલાં RNase પ્રવૃત્તિ કેવી રીતે અટકાવવામાં આવે છે તે પ્રશ્નને પદ્ધતિ ધ્યાનમાં લેતી નથી, પરંતુ પ્રાર્થના કરે છે કે પેશીના વિક્ષેપનો દર જે દરે ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર RNase RN ને અધોગતિ કરે છે તેના કરતા વધુ ઝડપી છે.

ઇલેક્ટ્રિક હોમોજેનાઇઝરની અસર વધુ સારી છે,અને ગ્લાસ હોમોજેનાઇઝરની અસર નબળી છે, પરંતુ સામાન્ય રીતે, હોમોજેનાઇઝર પદ્ધતિ અધોગતિની ઘટનાને અટકાવી શકતી નથી.તેથી, જો નિષ્કર્ષણ ડિગ્રેડ થાય છે, તો મૂળ ઇલેક્ટ્રિક હોમોજેનાઇઝરનો ઉપયોગ પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે પીસવા માટે કરવો જોઈએ;મૂળ ગ્લાસ હોમોજેનાઇઝરને ઇલેક્ટ્રિક હોમોજેનાઇઝરમાં બદલવું જોઈએ અથવા પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે સીધું મિલ્ડ કરવું જોઈએ.સમસ્યા લગભગ 100% શક્ય છે.ઉકેલ લાવો.

અનુગામી પ્રયોગોને અસર કરતી અશુદ્ધ અવશેષોની સમસ્યામાં અધોગતિ કરતાં વધુ વૈવિધ્યસભર કારણો છે અને તેના ઉકેલો પણ તે પ્રમાણે અલગ છે.નિષ્કર્ષમાં,જો પેશીઓમાં અધોગતિ અથવા અવશેષ અશુદ્ધિઓ હોય, તો ચોક્કસ પ્રાયોગિક સામગ્રી માટે નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ/રીએજન્ટને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવું આવશ્યક છે.ઑપ્ટિમાઇઝેશન માટે તમારે તમારા કિંમતી નમૂનાઓનો ઉપયોગ કરવાની જરૂર નથી: તમે બજારમાંથી માછલી/ચિકન જેવા કેટલાક નાના પ્રાણીઓ ખરીદી શકો છો, RNA નિષ્કર્ષણ માટે સામગ્રીનો અનુરૂપ ભાગ લઈ શકો છો, અને પ્રોટીન નિષ્કર્ષણ માટે બીજો ભાગ - મોં, પેટ અને આંતરડાના અર્ક સાથે પીસી શકો છો.

એક્સટ્રેક્ટેડ આરએનએના લક્ષ્ય આરએનએનો ઉપયોગ વિવિધ અનુવર્તી પ્રયોગો માટે થાય છે, અને તેની ગુણવત્તાની જરૂરિયાતો અલગ હોય છે.

સીડીએનએ લાઇબ્રેરીના નિર્માણ માટે એન્ઝાઇમ પ્રતિક્રિયા અવરોધકોના અવશેષો વિના આરએનએ અખંડિતતાની જરૂર છે;ઉત્તરીયને ઉચ્ચ આરએનએ અખંડિતતા અને એન્ઝાઇમ પ્રતિક્રિયા અવરોધકોના અવશેષો માટે ઓછી આવશ્યકતાઓની જરૂર છે;RT-PCR ને ખૂબ ઊંચી RNA અખંડિતતાની જરૂર નથી,પરંતુ એન્ઝાઇમ પ્રતિક્રિયાઓને અટકાવે છે.અવશેષ જરૂરિયાતો કડક છે.ઇનપુટ આઉટપુટ નક્કી કરે છે;દરેક વખતે જ્યારે ધ્યેય સર્વોચ્ચ શુદ્ધતા RNA મેળવવાનો હોય છે, ત્યારે તે લોકો અને પૈસા ખર્ચ કરશે.

નમૂનાઓનો સંગ્રહ/સંગ્રહ

અધોગતિને અસર કરતા પરિબળો નમૂના જીવંત શરીર/અથવા મૂળ વૃદ્ધિના વાતાવરણને છોડી દે તે પછી, નમૂનામાં રહેલા અંતર્જાત ઉત્સેચકો આરએનએને અધોગતિ કરવાનું શરૂ કરશે,અને અધોગતિ દર અંતર્જાત ઉત્સેચકોની સામગ્રી અને તાપમાન સાથે સંબંધિત છે.પરંપરાગત રીતે, અંતર્જાત એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને સંપૂર્ણપણે અટકાવવાની માત્ર બે રીતો છે: તરત જ લિસેટ ઉમેરો અને સંપૂર્ણ અને ઝડપથી એકરૂપ બનાવો;નાના ટુકડાઓમાં કાપો અને તરત જ પ્રવાહી નાઇટ્રોજનમાં સ્થિર કરો.બંને અભિગમોને ઝડપી કામગીરીની જરૂર છે.બાદમાં બધા નમૂનાઓ માટે યોગ્ય છે, જ્યારે પહેલાનું માત્ર કોશિકાઓ અને અંતર્જાત ઉત્સેચકોની ઓછી સામગ્રીવાળા પેશીઓ માટે યોગ્ય છે અને એકરૂપ થવામાં સરળ છે.ખાસ કરીને, છોડની પેશી, લીવર, થાઇમસ, સ્વાદુપિંડ, બરોળ, મગજ, ચરબી, સ્નાયુ પેશી, વગેરે આગળ વધતા પહેલા પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે શ્રેષ્ઠ રીતે સ્થિર થાય છે.

નમૂનાઓનું ફ્રેગમેન્ટેશન અને એકરૂપીકરણ

ડિગ્રેડેશન અને યીલ્ડ સેમ્પલ ફ્રેગમેન્ટેશનને અસર કરતા પરિબળો છેસંપૂર્ણ એકરૂપતા માટે, જે આરએનએના સંપૂર્ણ અને સંપૂર્ણ પ્રકાશન માટે છે.કોષો તૂટ્યા વિના સીધા જ એકરૂપ થઈ શકે છે.પેશીઓ તૂટ્યા પછી જ એકરૂપ થઈ શકે છે.યીસ્ટ અને બેક્ટેરિયાને એકરૂપ બનાવતા પહેલા તેને અનુરૂપ ઉત્સેચકો સાથે તોડી નાખવાની જરૂર છે.નીચા અંતર્જાત એન્ઝાઇમ સામગ્રી અને સરળ એકરૂપીકરણ સાથેના પેશીઓને એક સમયે લાયસેટમાં હોમોજેનાઇઝર દ્વારા કચડી અને એકરૂપ કરી શકાય છે;છોડની પેશી, યકૃત, થાઇમસ, સ્વાદુપિંડ, બરોળ, મગજ, ચરબી, સ્નાયુ પેશી અને અન્ય નમૂનાઓ, તેઓ કાં તો અંતર્જાત ઉત્સેચકોમાં વધુ હોય છે અથવા સરળતાથી એકરૂપ થતા નથી,તેથી પેશી વિક્ષેપ અને એકરૂપીકરણ અલગથી થવું જોઈએ.ફ્રેગમેન્ટેશનની સૌથી વિશ્વસનીય અને સૌથી વધુ ઉત્પાદક પદ્ધતિ પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે મિલિંગ છે, અને એકરૂપીકરણની સૌથી વિશ્વસનીય પદ્ધતિ ઇલેક્ટ્રિક હોમોજેનાઇઝરનો ઉપયોગ છે.પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે પીસવા વિશેની ખાસ નોંધ: સમગ્ર દળવાની પ્રક્રિયા દરમિયાન નમૂનાને પીગળવું જોઈએ નહીં, કારણ કે જ્યારે સ્થિર થાય છે ત્યારે અંતર્જાત ઉત્સેચકો વધુ કાર્ય કરે છે.

લિસેટની પસંદગી

ઓપરેશનની સુવિધા અને અવશેષ અંતર્જાત અશુદ્ધિઓના પરિબળોને અસર કરતા સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા લિસિસ સોલ્યુશન્સ લગભગ RNase ની પ્રવૃત્તિને અટકાવી શકે છે.તેથી, લિસિસ સોલ્યુશન પસંદ કરવાના મુખ્ય મુદ્દાને શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ સાથે સંયોજનમાં ધ્યાનમાં લેવાનું છે.ત્યાં એક અપવાદ છે:એન્ડોજેનસ એન્ઝાઇમની ઉચ્ચ સામગ્રીવાળા નમૂનાઓને એન્ડોજેનસ એન્ઝાઇમને નિષ્ક્રિય કરવાની ક્ષમતા વધારવા માટે ફિનોલ ધરાવતા લાયસેટનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિની પસંદગી

અવશેષ અંતર્જાત અશુદ્ધિઓને અસર કરતા પરિબળો, નિષ્કર્ષણની ઝડપ કોષો જેવા સ્વચ્છ નમૂનાઓ માટે, લગભગ કોઈપણ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ હાથ ધરવાથી સંતોષકારક પરિણામો મેળવી શકાય છે.પરંતુ અન્ય ઘણા નમૂનાઓ માટે, ખાસ કરીને છોડ, યકૃત, બેક્ટેરિયા વગેરે જેવા ઉચ્ચ સ્તરની અશુદ્ધિઓ ધરાવતા, યોગ્ય શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ પસંદ કરવી મહત્વપૂર્ણ છે.કોલમ સેન્ટ્રીફ્યુગલ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ ઝડપી નિષ્કર્ષણ ગતિ ધરાવે છે અને તે અશુદ્ધિઓને અસરકારક રીતે દૂર કરી શકે છે જે આરએનએની અનુગામી એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયાને અસર કરે છે, પરંતુ તે ખર્ચાળ છે (ફોરેજીન ખર્ચ-અસરકારક કિટ ઓફર કરી શકે છે, વધુ વિગતો ક્લિક કરોઅહીં);આર્થિક અને ઉત્તમ શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને, જેમ કે LiCl વરસાદ, પણ સંતોષકારક પરિણામો મેળવી શકે છે, પરંતુ ઓપરેશનનો સમય લાંબો છે..

RNA નિષ્કર્ષણ માટે "ત્રણ શિસ્ત અને આઠ ધ્યાન".

શિસ્ત 1:બાહ્ય ઉત્સેચકોના દૂષણનો અંત લાવો.

નોંધ 1:સખત રીતે માસ્ક અને મોજા પહેરો.

નોંધ 2:પ્રયોગમાં સામેલ સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ, ટીપ હેડ, પીપેટ સળિયા, ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ ટેન્ક અને પ્રાયોગિક બેન્ચનો સંપૂર્ણ રીતે નિકાલ કરવો જોઈએ.

નોંધ 3:પ્રયોગમાં સામેલ રીએજન્ટ/સોલ્યુશન્સ, ખાસ કરીને પાણી, RNase-મુક્ત હોવા જોઈએ.

શિસ્ત 2:અંતર્જાત ઉત્સેચકોની પ્રવૃત્તિને અવરોધિત કરો

નોંધ 4:યોગ્ય એકરૂપીકરણ પદ્ધતિ પસંદ કરો.

નોંધ 5:યોગ્ય lysate પસંદ કરો.

નોંધ 6:નમૂનાની પ્રારંભિક રકમને નિયંત્રિત કરો.

શિસ્ત 3:તમારા નિષ્કર્ષણ હેતુ સ્પષ્ટ કરો

નોંધ 7:કોઈપણ lysate સિસ્ટમ નમૂનાની મહત્તમ પ્રારંભિક રકમની નજીક પહોંચવા સાથે, નિષ્કર્ષણની સફળતાનો દર ઝડપથી ઘટી જાય છે.

નોંધ 8:સફળ આરએનએ નિષ્કર્ષણ માટેનો એકમાત્ર આર્થિક માપદંડ એ પછીના પ્રયોગોમાં સફળતા છે, ઉપજ નહીં.

RNase દૂષણના ટોચના 10 સ્ત્રોતો

1. આંગળીઓ એ બાહ્ય ઉત્સેચકોનો પ્રથમ સ્ત્રોત છે, તેથી મોજા પહેરવા અને વારંવાર બદલવા જોઈએ.આ ઉપરાંત, માસ્ક પણ પહેરવા જોઈએ, કારણ કે શ્વાસ એ એન્ઝાઇમનો એક મહત્વપૂર્ણ સ્ત્રોત છે.ગ્લોવ માસ્ક પહેરવાનો એક વધારાનો ફાયદો એ છે કે પ્રયોગકર્તાનું રક્ષણ કરવું.

2. પીપેટ ટીપ્સ, સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ, પીપેટ - આરનેઝને એકલા નસબંધી દ્વારા નિષ્ક્રિય કરી શકાતું નથી, તેથી પીપેટ ટીપ્સ અને સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબને ડીઈપીસી સાથે સારવાર કરવી જોઈએ, પછી ભલે તે ડીઈપીસી તરીકે ચિહ્નિત થયેલ હોય.વિશિષ્ટ હેતુવાળા પીપેટનો ઉપયોગ કરવો શ્રેષ્ઠ છે, ઉપયોગ કરતા પહેલા તેને 75% આલ્કોહોલ કોટન બોલથી સાફ કરો, ખાસ કરીને સળિયા;વધુમાં, હેડ રીમુવરનો ઉપયોગ ન કરવાની ખાતરી કરો.

3. પાણી/બફર RNase દૂષણથી મુક્ત હોવું જોઈએ.

4. ઓછામાં ઓછું ટેસ્ટ ટેબલ 75% આલ્કોહોલ કોટન બોલથી સાફ કરવું જોઈએ.

5.અંતર્જાત RNase તમામ પેશીઓમાં અંતર્જાત ઉત્સેચકો હોય છે, તેથી પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સાથે પેશીઓને ઝડપથી ઠંડું પાડવું એ અધોગતિ ઘટાડવાનો શ્રેષ્ઠ માર્ગ છે.પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સંગ્રહ/ગ્રાઇન્ડીંગ પદ્ધતિ ખરેખર અસુવિધાજનક છે, પરંતુ અંતર્જાત ઉત્સેચકોના ઉચ્ચ સ્તરો ધરાવતા પેશીઓ માટે તે એકમાત્ર રસ્તો છે.

6. RNA નમૂનાઓ RNA નિષ્કર્ષણ ઉત્પાદનોમાં RNase દૂષણના નિશાન હોઈ શકે છે.

7. પ્લાઝમિડ નિષ્કર્ષણ પ્લાઝમિડ નિષ્કર્ષણ RNA ને અધોગતિ કરવા માટે Rnase નો ઉપયોગ કરે છે, અને શેષ Rnase ને Proteinase K સાથે પાચન કરવું જોઈએ અને PCI દ્વારા કાઢવામાં આવે છે.

8. RNA સંગ્રહ ભલે તે નીચા તાપમાને સંગ્રહિત હોય, RNase ના ટ્રેસ પ્રમાણ RNA અધોગતિનું કારણ બને છે.RNA ના લાંબા ગાળાની જાળવણી માટેનો શ્રેષ્ઠ ઉપાય એ મીઠું/આલ્કોહોલ સસ્પેન્શન છે, કારણ કે આલ્કોહોલ નીચા તાપમાને તમામ એન્ઝાઈમેટિક પ્રવૃત્તિને અટકાવે છે.

9. જ્યારે કેશન (Ca, Mg) માં આ આયનો હોય છે, ત્યારે 5 મિનિટ માટે 80C પર ગરમ કરવાથી RNA ક્લીવ થઈ જાય છે, તેથી જો RNAને ગરમ કરવાની જરૂર હોય, તો પ્રિઝર્વેશન સોલ્યુશનમાં ચેલેટીંગ એજન્ટ (1mM સોડિયમ સાઇટ્રેટ, pH 6.4) હોવું જરૂરી છે.

10. અનુગામી પ્રયોગોમાં ઉપયોગમાં લેવાતા ઉત્સેચકો RNase દ્વારા દૂષિત થઈ શકે છે.

RNA નિષ્કર્ષણ માટે 10 ટિપ્સ

1: RNase પ્રવૃત્તિને ઝડપથી અટકાવો.નમૂનાઓ સંગ્રહ કર્યા પછી ઝડપથી સ્થિર થઈ જાય છે, અને lysis દરમિયાન ઝડપી ઓપરેશન દ્વારા RNase નિષ્ક્રિય થઈ જાય છે.

2: ઉચ્ચ રાઈબોઝાઇમ સામગ્રીવાળા પેશીઓ માટે યોગ્ય નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિ પસંદ કરો અને એડિપોઝ પેશી ફિનોલ ધરાવતી પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવા માટે શ્રેષ્ઠ છે.

3: અનુમાન ગુણવત્તા માટે ઉત્તરીયની જરૂર છે, cDNA લાઇબ્રેરીના નિર્માણ માટે ઉચ્ચ અખંડિતતાની જરૂર છે, અને RT-PCR અને RPA (રિબોન્યુક્લીઝ પ્રોટેક્શન એસે) માટે ઉચ્ચ અખંડિતતાની જરૂર નથી.RT-PCR ને ઉચ્ચ શુદ્ધતા (એન્ઝાઇમ અવરોધક અવશેષો) ની જરૂર છે.

4: સંપૂર્ણ એકરૂપીકરણ એ ઉપજ સુધારવા અને અધોગતિ ઘટાડવા માટેની ચાવી છે.

5: RNA ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ શોધની અખંડિતતા તપાસો, 28S: 18S = 2:1 એ સંપૂર્ણ સંકેત છે, 1:1 મોટાભાગના પ્રયોગો માટે પણ સ્વીકાર્ય છે.

6: RT-PCR, એરે વિશ્લેષણ માટે DNA દૂર કરવું DNA દૂર કરવા માટે Dnase I નો ઉપયોગ કરવો શ્રેષ્ઠ છે.

7: બાહ્ય ઉત્સેચકોના દૂષણને ઓછું કરો - ઉત્સેચકો બહારથી આયાત કરી શકાતા નથી.

8: ઓછી સાંદ્રતાવાળા ન્યુક્લીક એસિડને કેન્દ્રિત કરતી વખતે, સહ-અવક્ષેપ રીએજન્ટ ઉમેરવું જોઈએ.પરંતુ ઉત્સેચકો અને ડીએનએ દૂષણ ધરાવતા સહ-પ્રવૃત્તિને રોકવા માટે.

9: આરએનએને સારી રીતે ઓગાળો, જો જરૂરી હોય તો, 5 મિનિટ માટે 65C પર ગરમ કરો.

યોગ્ય સંગ્રહ પદ્ધતિ

તે ટૂંકા સમય માટે -20C પર અને લાંબા સમય માટે -80C પર સંગ્રહિત કરી શકાય છે.આરએનએ ઉપજમાં સુધારો કરવા માટેનું પ્રથમ પગલું એ સમજવું છે કે વિવિધ નમૂનાઓની આરએનએ સામગ્રી મોટા પ્રમાણમાં બદલાય છે.ઉચ્ચ વિપુલતા (2-4ug/mg) જેમ કે યકૃત, સ્વાદુપિંડ, હૃદય, મધ્યમ વિપુલતા (0.05-2ug/mg) જેમ કે મગજ, ગર્ભ, કિડની, ફેફસા, થાઇમસ, અંડાશય, ઓછી વિપુલતા (<0.05ug/mg) mg) જેમ કે મૂત્રાશય, અસ્થિ, ચરબી.

1: RN છોડવા માટે લાયસ કોષો - જો RNA છોડવામાં નહીં આવે, તો ઉપજમાં ઘટાડો થશે.ઇલેક્ટ્રિક હોમોજનાઇઝેશન અન્ય એકરૂપીકરણ પદ્ધતિઓ કરતાં વધુ સારી રીતે કાર્ય કરે છે, પરંતુ તેને અન્ય પદ્ધતિઓ સાથે પણ જોડવાની જરૂર પડી શકે છે, જેમ કે પ્રવાહી નાઇટ્રોજન મેશિંગ, એન્ઝાઇમેટિક પાચન (લાઇસોઝાઇમ/લિટીકેઝ)

2: નિષ્કર્ષણ પદ્ધતિનું ઑપ્ટિમાઇઝેશન.ફિનોલ-આધારિત પદ્ધતિઓમાં સૌથી મોટી સમસ્યાઓ અપૂર્ણ સ્તરીકરણ અને આંશિક RNA નુકશાન (સુપરનેટન્ટને સંપૂર્ણપણે દૂર કરી શકાતી નથી) છે.અપૂર્ણ સ્તરીકરણ ઉચ્ચ ન્યુક્લીક એસિડ અને પ્રોટીન સામગ્રીને કારણે છે, જે ઉપયોગમાં લેવાતા લિસેટની માત્રામાં વધારો કરીને અથવા નમૂનાની માત્રામાં ઘટાડો કરીને ઉકેલી શકાય છે.એડિપોઝ પેશીઓમાં ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણનું એક પગલું ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.આરએનએ નુકસાન બેક-પમ્પિંગ દ્વારા અથવા સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અનુસરવામાં આવેલા કાર્બનિક સ્તરને દૂર કરીને ઘટાડી શકાય છે.કૉલમ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન-આધારિત પદ્ધતિઓની સૌથી મોટી સમસ્યા એ છે કે વધુ પડતા નમૂના.

ઉત્તમ નમૂનાના નિષ્કર્ષણ ટિપ્સ

1. ફિનોલ શુદ્ધિકરણ: 1:1 ફેનોલ/ક્લોરોફોર્મની સમાન માત્રા ઉમેરો અને 1-2 મિનિટ માટે જોરશોરથી ભળી દો.2 મિનિટ માટે હાઇ સ્પીડ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.સુપરનેટન્ટ (80-90%) ને કાળજીપૂર્વક દૂર કરો.મધ્યમ સ્તર પર ક્યારેય ન આવો.ફિનોલ/ક્લોરોફોર્મમાં પ્રતિક્રિયા સોલ્યુશનની સમાન માત્રા ઉમેરી શકાય છે અને સુપરનેટન્ટ દૂર કરી શકાય છે.ઉપજમાં સુધારો કરવા માટે ન્યુક્લીક એસિડ અવક્ષેપ માટે બે સુપરનેટન્ટ્સને એકસાથે મિશ્રિત કરી શકાય છે.મિશ્રણ કરતી વખતે ખૂબ નમ્ર બનો નહીં, અને બધા સુપરનેટન્ટને દૂર કરવાનો પ્રયાસ કરશો નહીં.

2. 70-80% ઇથેનોલથી ધોવા: ધોવા દરમિયાન, શેષ મીઠું ધોવાઇ જાય તેની ખાતરી કરવા માટે ન્યુક્લિક એસિડને સસ્પેન્ડ કરવું આવશ્યક છે.તે જ સમયે, ઇથેનોલ રેડ્યા પછી તરત જ, થોડી સેકંડ માટે હાઇ સ્પીડ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો અને પછી પીપેટ વડે શેષ ઇથેનોલ દૂર કરો.ઓરડાના તાપમાને 5-10 મિનિટ ઊભા રહ્યા પછી વિસર્જન કરો.

11. વિશેષ સંસ્થાઓનું નિષ્કર્ષણ

1. તંતુમય પેશીઓ: હૃદય/હાડપિંજરના સ્નાયુ જેવા તંતુમય પેશીઓમાંથી આરએનએ નિષ્કર્ષણની ચાવી એ પેશીઓને સંપૂર્ણપણે વિક્ષેપિત કરવી છે.આ પેશીઓમાં કોષની ઘનતા ઓછી હોય છે, તેથી પેશીઓના એકમ વજન દીઠ આરએનએની માત્રા ઓછી હોય છે, અને શક્ય તેટલી પ્રારંભિક રકમનો ઉપયોગ કરવો શ્રેષ્ઠ છે.ઠંડકની સ્થિતિમાં પેશીને સારી રીતે ગ્રાઇન્ડ કરવાની ખાતરી કરો.

2. ઉચ્ચ પ્રોટીન/ચરબી સામગ્રી સાથે પેશીઓ: મગજ/વનસ્પતિ ચરબીનું પ્રમાણ વધારે છે.પીસીઆઈ નિષ્કર્ષણ પછી, સુપરનેટન્ટમાં સફેદ ફ્લોક્યુલ્સ હોય છે.સુપરનેટન્ટને ક્લોરોફોર્મ સાથે ફરીથી કાઢવામાં આવશ્યક છે.

3. ઉચ્ચ ન્યુક્લીક એસિડ/રિબોઝાઇમ સામગ્રી સાથેની પેશીઓ: બરોળ/થાઇમસમાં ઉચ્ચ ન્યુક્લીક એસિડ અને રિબોઝાઇમ સામગ્રી હોય છે.ઠંડકની સ્થિતિમાં પેશીને પીસવાથી ઝડપી એકરૂપીકરણ દ્વારા અસરકારક રીતે રિબોઝાઇમ્સને નિષ્ક્રિય કરી શકાય છે.જો કે, જો લાયસેટ ખૂબ ચીકણું હોય (ન્યુક્લીક એસિડની ઉચ્ચ સામગ્રીને કારણે), તો PCI નિષ્કર્ષણ અસરકારક રીતે સ્તરીકરણ કરવામાં સક્ષમ રહેશે નહીં;વધુ lysate ઉમેરવાથી આ સમસ્યા હલ થઈ શકે છે.બહુવિધ PCI નિષ્કર્ષણ વધુ શેષ ડીએનએ દૂર કરી શકે છે.જો આલ્કોહોલ ઉમેર્યા પછી તરત જ સફેદ અવક્ષેપ રચાય છે, તો તે ડીએનએ દૂષણ સૂચવે છે.વિસર્જન પછી એસિડિક PCI સાથે ફરીથી નિષ્કર્ષણ DNA દૂષણને દૂર કરી શકે છે.

4. છોડની પેશી: છોડની પેશી પ્રાણીની પેશીઓ કરતાં વધુ જટિલ હોય છે.સામાન્ય રીતે, છોડ પ્રવાહી નાઇટ્રોજનની સ્થિતિમાં જમીન પર હોય છે, તેથી અંતર્જાત ઉત્સેચકો દ્વારા આરએનએનું અધોગતિ અસામાન્ય છે.જો અધોગતિની સમસ્યાનો ઉકેલ ન આવે તો, તે લગભગ ચોક્કસપણે નમૂનામાં રહેલી અશુદ્ધિઓને કારણે થાય છે.ઘણા છોડમાં રહેલી અશુદ્ધિઓ અવશેષો તરફ દોરી જાય છે, અને અવશેષોનું કારણ ઘણીવાર એ છે કે આ અશુદ્ધિઓમાં આરએનએ સાથે કેટલીક સમાનતાઓ હોય છે: તમે અવક્ષેપ કરો છો અને હું અવક્ષેપ કરો છો, અને તમે શોષી શકો છો અને હું શોષીશ.આ લાક્ષણિકતાઓ નક્કી કરે છે કે તેઓ ખૂબ જ મજબૂત એન્ઝાઇમ અવરોધકો છે.

હાલમાં, વાણિજ્યિક આરએનએ નિષ્કર્ષણ રીએજન્ટને નાના ગોઠવણો સાથે લગભગ તમામ પ્રાણી પેશીઓમાં અનુકૂલિત કરી શકાય છે, પરંતુ ત્યાં થોડા વ્યવસાયિક આરએનએ નિષ્કર્ષણ રીએજન્ટ્સ છે જે મોટાભાગના છોડની પેશીઓ માટે યોગ્ય હોઈ શકે છે.સદનસીબે, ફોરજીન વિશેષ પ્રદાન કરી શકે છેપ્લાન્ટ આરએનએ નિષ્કર્ષણ કિટ્સ, અમારી પાસેપ્લાન્ટ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ, પ્લાન્ટ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ પ્લસ.બાદમાં ખાસ કરીને ઉચ્ચ પોલિસેકરાઇડ અને પોલિફેનોલ સામગ્રીવાળા છોડ માટે રચાયેલ છે.RNA નિષ્કર્ષણ માટે, લેબ વપરાશકર્તાઓ તરફથી પ્રતિસાદ ખાસ કરીને સારો છે.

12. સેમ્પલ ફ્રીઝિંગ અને પીગળવાની અસર થીજી ગયેલા સેમ્પલ મોટા હોઈ શકે છે અને RNA એક્સટ્રક્શન માટે ઉપયોગમાં લેવાતા પહેલા તેને કાપવાની જરૂર છે.કટીંગ દરમિયાન નમૂનાઓ ઓગળી જાય છે (કદાચ આંશિક રીતે).RNA નિષ્કર્ષણ પહેલાં સ્થિર નમૂનાઓનું વજન કરવાની જરૂર પડી શકે છે, અને આ પ્રક્રિયા દરમિયાન પીગળવું ચોક્કસપણે થશે.કેટલીકવાર, પ્રવાહી નાઇટ્રોજન મિલિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન નમૂનાનું પીગળવું પણ થાય છે;અથવા સ્થિર નમૂનાને પ્રવાહી નાઇટ્રોજન મિલિંગ વિના સીધા જ લાઇસેટમાં ઉમેરવામાં આવે છે, અને સંપૂર્ણ એકરૂપતા પહેલા પીગળવું ચોક્કસપણે થશે.પ્રયોગોએ દર્શાવ્યું છે કે તાજા પેશીઓ કરતાં પીગળતી વખતે સ્થિર પેશી આરએનએ અધોગતિ માટે વધુ સંવેદનશીલ હોય છે.સંભવિત કારણ: ફ્રીઝ-થૉ પ્રક્રિયા કોષની અંદરની રચનાઓને ખલેલ પહોંચાડે છે, જે અંતર્જાત ઉત્સેચકોને RNA સાથે સીધા સંપર્કમાં આવવાનું સરળ બનાવે છે.

13. આરએનએ ગુણવત્તાનો નિર્ણય સામાન્ય રીતે, ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ આરએનએની અખંડિતતા નક્કી કરવા માટે થાય છે, અને A260/A280 નો ઉપયોગ આરએનએની શુદ્ધતા નક્કી કરવા માટે થાય છે.સિદ્ધાંતમાં, અખંડ આરએનએ 28S:18S = 2.7:1 નો ગુણોત્તર ધરાવે છે, અને મોટાભાગના ડેટા 28S:18S = 2:1 ના ગુણોત્તર પર ભાર મૂકે છે.હકીકત એ છે કે કોષો સિવાયના નમૂનાઓમાંથી કાઢવામાં આવેલ લગભગ કોઈ પણ RNA 2:1 રેશિયોમાં નથી (આ Agilent Bioanalyzer નો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યું હતું).

આરએનએના ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ પરિણામો ઘણા પરિબળોથી પ્રભાવિત થાય છે, જેમાં ગૌણ માળખું, ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ સ્થિતિ, નમૂનાનો ભાર, ઇબી દ્વારા સંતૃપ્તિની ડિગ્રી વગેરેનો સમાવેશ થાય છે. આરએનએ શોધવા માટે મૂળ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસનો ઉપયોગ કરો અને નિયંત્રણ તરીકે ડીએનએ માર્કરનો ઉપયોગ કરો.જો 2kb પર 28S અને 0.9kb પર 18S સ્પષ્ટ છે, અને 28S: 18S > 1, તો અખંડિતતા મોટા ભાગના અનુગામી પ્રયોગોની જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરી શકે છે.

A260/A280 એ એક સૂચક છે જેણે ઘણી મૂંઝવણ ઊભી કરી છે.સૌ પ્રથમ, ન્યુક્લિક એસિડ માટે આ સૂચકનો મૂળ અર્થ સ્પષ્ટ કરવો જરૂરી છે: શુદ્ધ આરએનએ, તેનો A260/280 = લગભગ 2.0.શુદ્ધ RNA એ 'કારણ' છે અને A260/A280 = 2 એ 'ઇફેક્ટ' છે.હવે દરેક જણ A260/A280 નો ઉપયોગ 'કારણ' તરીકે કરે છે, એવું વિચારીને કે "જો A260/A280 = 2 હોય, તો RNA શુદ્ધ છે", જે સ્વાભાવિક રીતે મૂંઝવણ તરફ દોરી જાય છે.

જો તમને રસ હોય, તો તમે તમારા આરએનએ નમૂનામાં ફિનોલ, ગુઆનીડીન આઇસોથિયોસાયનેટ, પીઇજી, વગેરે જેવા નિષ્કર્ષણમાં ઉપયોગમાં લેવાતા થોડું રીએજન્ટ ઉમેરી શકો છો અને પછી A260/A280 ગુણોત્તર માપી શકો છો.વાસ્તવિકતા એ છે કે RNA નિષ્કર્ષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા ઘણા રીએજન્ટ્સ, તેમજ નમૂનામાં ઘણી અશુદ્ધિઓ, A260 અને A280 ની આસપાસ શોષી લે છે, જે A260/A280 ને અસર કરે છે.

હાલમાં સૌથી ઉપદેશક અભિગમ 200-300 nm રેન્જમાં RNA નમૂનાઓ સ્કેન કરવાનો છે.શુદ્ધ આરએનએના વળાંકમાં નીચેની લાક્ષણિકતાઓ છે: વળાંક સરળ છે, A230 અને A260 બે વળાંક બિંદુઓ છે, A300 0 ની નજીક છે, A260/A280 = 2.0 આસપાસ છે, અને A260/A230 = 2.0 આસપાસ છે.જો સ્કેન ડેટા ઉપલબ્ધ ન હોય, તો A260/A230 રેશિયો પણ નક્કી કરવો જોઈએ, કારણ કે આ ગુણોત્તર એન્ઝાઈમેટિક પ્રતિક્રિયાને અસર કરતી તમામ અશુદ્ધિઓના વહન માટે વધુ સંવેદનશીલ છે.ઉપકરણની રેખીય શ્રેણીને ધ્યાનમાં લો (A260 માટે 0.1–0.5).

ત્યાં અન્ય બે ઉપયોગી ઘટનાઓ છે: જ્યારે A260/A280 પાણીમાં માપવામાં આવે ત્યારે ગુણોત્તર લગભગ 0.3 ઓછો હશે;જ્યારે 10 mM EDTA માં માપવામાં આવેલ ગુણોત્તર 1 mM EDTA માં માપવામાં આવેલ ગુણોત્તર કરતા લગભગ 0.2 વધારે છે.

સંબંધિત વસ્તુઓ:

ચાઇના પ્લાન્ટ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ ઉત્પાદક અને સપ્લાયર |ફોરજીન (foreivd.com)

આરએનએ અલગતા શ્રેણી સપ્લાયર્સ અને ફેક્ટરી |ચાઇના આરએનએ આઇસોલેશન સિરીઝ મેન્યુફેક્ચરર્સ (foreivd.com)

આરએનએ આઇસોલેશન સિરીઝ – ફોરજીન કું., લિ. (foreivd.com)