અમે અનુભવી ઉત્પાદક છીએ.મોટા ડિસ્કાઉન્ટિંગ ચાઇના હાઇ સેન્સિટિવિટી વન-સ્ટેપ પ્રોબ Rt- માટે તેના બજારના નિર્ણાયક પ્રમાણપત્રોમાં બહુમતી જીતવી.Qpcrકિટ V2, ગુણવત્તા એ ફેક્ટરીનું જીવન છે, ગ્રાહકની માંગ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરવું એ કંપનીના અસ્તિત્વ અને વિકાસનો સ્ત્રોત છે, અમે તમારા આવવાની રાહ જોઈને, પ્રમાણિકતા અને સદ્ભાવનાથી કામ કરવાના વલણને વળગી રહીએ છીએ!
અમે અનુભવી ઉત્પાદક છીએ.માટે તેના બજારના નિર્ણાયક પ્રમાણપત્રોમાં બહુમતી જીતવીચાઇના તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ, Qpcr, અમારી કંપની વચન આપે છે: વાજબી કિંમતો, ટૂંકા ઉત્પાદન સમય અને સંતોષકારક વેચાણ પછીની સેવા, અમે તમને ગમે ત્યારે અમારી ફેક્ટરીની મુલાકાત લેવા માટે પણ આવકારીએ છીએ.ઈચ્છો કે હવે અમારી પાસે એક સુખદ અને લાંબા ગાળાનો વ્યવસાય છે!!!

વર્ણનો

આ કિટ એક અનન્ય લિસિસ બફર સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરે છે જે RT-qPCR પ્રતિક્રિયાઓ માટે સંસ્કારી કોષના નમૂનાઓમાંથી ઝડપથી RNA મુક્ત કરી શકે છે, જેનાથી સમય માંગી લેતી અને કપરી RNA શુદ્ધિકરણ પ્રક્રિયા દૂર થાય છે.આરએનએ ટેમ્પ્લેટ માત્ર 7 મિનિટમાં મેળવી શકાય છે.કિટ દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ 5×ડાયરેક્ટ RT મિક્સ અને 2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-SYBR રીએજન્ટ ઝડપથી અને અસરકારક રીતે રીઅલ-ટાઇમ જથ્થાત્મક PCR પરિણામો મેળવી શકે છે.

5×Direct RT Mix અને 2×Direct qPCR Mix-SYBR મજબૂત અવરોધક સહિષ્ણુતા ધરાવે છે, અને નમૂનાઓના lysateનો ઉપયોગ RT-qPCR માટે સીધા નમૂના તરીકે કરી શકાય છે.આ કીટમાં અનન્ય આરએનએ હાઇ-એફિનિટી ફોરજીન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને હોટ ડી-ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ, ડીએનટીપી, એમજીસીએલ છે.₂, પ્રતિક્રિયા બફર, પીસીઆર ઑપ્ટિમાઇઝર અને સ્ટેબિલાઇઝર.

વિશિષ્ટતાઓ

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

કીટ ઘટકો

સુવિધાઓ અને ફાયદા

■ સરળ અને અસરકારક : સેલ ડાયરેક્ટ RT ટેક્નોલોજી સાથે, RNA સેમ્પલ માત્ર 7 મિનિટમાં મેળવી શકાય છે.

■ નમૂનાની માંગ ઓછી છે, 10 જેટલા ઓછા કોષોનું પરીક્ષણ કરી શકાય છે.

■ ઉચ્ચ થ્રુપુટ: તે ઝડપથી 384, 96, 24, 12, 6-વેલ પ્લેટમાં સંસ્કારી કોષોમાં આરએનએ શોધી શકે છે.

■ ડીએનએ ઇરેઝર રીલીઝ થયેલા જીનોમને ઝડપથી દૂર કરી શકે છે, ત્યારબાદના પ્રાયોગિક પરિણામો પરની અસરને મોટા પ્રમાણમાં ઘટાડી શકે છે.

■ ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ RT અને qPCR સિસ્ટમ બે-પગલાં RT-PCR રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનને વધુ કાર્યક્ષમ અને PCR વધુ ચોક્કસ બનાવે છે, અને RT-qPCR પ્રતિક્રિયા અવરોધકોને વધુ પ્રતિરોધક બનાવે છે.

કીટ એપ્લિકેશન

એપ્લિકેશનનો અવકાશ: સંસ્કારી કોષો.

- સેમ્પલ લિસિસ દ્વારા બહાર પાડવામાં આવેલ RNA: આ કિટના RT-qPCR ટેમ્પલેટને જ લાગુ પડે છે.

- કીટનો ઉપયોગ નીચેના હેતુઓ માટે થઈ શકે છે: જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ, siRNA- મધ્યસ્થી જનીન સાયલન્સિંગ અસરની ચકાસણી, દવાની તપાસ વગેરે.

ડાયાગ્રામ

સંગ્રહ અને શેલ્ફ જીવન

આ કીટનો ભાગ I 4℃ પર સંગ્રહિત થવો જોઈએ;ભાગ II -20℃ પર સંગ્રહિત થવો જોઈએ.

ફોરજીન પ્રોટીઝ પ્લસ II 4℃ પર સંગ્રહિત થવો જોઈએ, -20℃ પર સ્થિર થશો નહીં.

રીએજન્ટ 2×Direct qPCR Mix-SYBR ને અંધારામાં -20℃ પર સંગ્રહિત કરવું જોઈએ;જો વારંવાર ઉપયોગ કરવામાં આવે તો, તે ટૂંકા ગાળાના સ્ટોરેજ માટે 4℃ પર પણ સંગ્રહિત કરી શકાય છે (10 દિવસમાં ઉપયોગ કરો). અમે અનુભવી ઉત્પાદક છીએ.મોટા ડિસ્કાઉન્ટિંગ ચાઇના હાઇ સેન્સિટિવિટી વન-સ્ટેપ પ્રોબ Rt-Qpcr Kit V2 માટે તેના બજારના નિર્ણાયક પ્રમાણપત્રોમાં બહુમતી જીતવી, ગુણવત્તા એ ફેક્ટરી જીવન છે , ગ્રાહકની માંગ પર ફોકસ એ કંપનીના અસ્તિત્વ અને વિકાસનો સ્ત્રોત છે, અમે પ્રમાણિકતા અને સદ્ભાવના કામના વલણનું પાલન કરીએ છીએ, તમારા આવવાની રાહ જોઈ રહ્યા છીએ!
મોટું ડિસ્કાઉન્ટિંગચાઇના તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ, Qpcr, અમારી કંપની વચન આપે છે: વાજબી કિંમતો, ટૂંકા ઉત્પાદન સમય અને સંતોષકારક વેચાણ પછીની સેવા, અમે તમને ગમે ત્યારે અમારી ફેક્ટરીની મુલાકાત લેવા માટે પણ આવકારીએ છીએ.ઈચ્છો કે હવે અમારી પાસે એક સુખદ અને લાંબા ગાળાનો વ્યવસાય છે!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qપીસીઆર Kit -તાકમan

Cat.No.DRT-01021/01022

≤ 1000,000 કોષોનો ઉપયોગ કરીને સેલ ડાયરેક્ટ RT-qPCR માટે

ઉત્પાદન પરિચય

આ ઉત્પાદન RT-qPCR પ્રતિક્રિયાઓ માટે સંસ્કારી કોષના નમૂનાઓમાંથી ઝડપથી RNA મુક્ત કરવા માટે અનન્ય લિસિસ બફર સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરે છે, જે સમય માંગી લેતી અને કપરી આરએનએ શુદ્ધિકરણ પ્રક્રિયાને દૂર કરે છે, અને જરૂરી RNA ટેમ્પલેટ મેળવવા માટે માત્ર 7 મિનિટમાં, 5× ડાયરેક્ટ RT મિક્સ, 2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-Taquitman દ્વારા ઝડપથી પ્રદાન કરવામાં આવે છે. પરિણામો

5× ડાયરેક્ટ RT મિક્સ અને 2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-ટાકમેન મજબૂત અવરોધક સહિષ્ણુતા ધરાવે છે અને નમૂના તરીકે માપવા માટેના નમૂનાના લાઇસેટનો ઉપયોગ કરીને કાર્યક્ષમ રિવર્સલ અને ચોક્કસ એમ્પ્લીફિકેશન કરી શકે છે.રીએજન્ટમાં ફોરજીન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, હોટ ડી-ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ, ડીએનટીપી, એમજીસીએલ હોય છે.₂, રિએક્શન બફર, પીસીઆર ઑપ્ટિમાઇઝર અને સ્ટેબિલાઇઝર, જે નમૂનાઓને ઝડપથી અને સરળતાથી શોધી કાઢવા માટે લિસિસ બફર સાથે વાપરી શકાય છે, અને ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા, વિશિષ્ટતા અને સ્થિરતાના લક્ષણો ધરાવે છે.

ઉત્પાદનના લક્ષણો

સરળ, અસરકારક સેલ ડાયરેક્ટ આરટી ટેક્નોલોજી જે RNA સેમ્પલ મેળવવા માટે 7 મિનિટ જેટલો ઓછો સમય લે છે.

નમૂનાની આવશ્યકતાઓ નાની છે, અને પ્રયોગ માટે ઓછામાં ઓછા 10 સંસ્કારી કોષોનો ઉપયોગ કરી શકાય છે.

384, 96, 24, 12 અને 6-વેલ પ્લેટ જેવા સંસ્કારી કોષોના ઝડપી આરએનએ સંપાદન માટે ઉચ્ચ થ્રુપુટ.

ડીએનએ ઇરેઝર રીલીઝ થયેલ જીનોમને ઝડપથી દૂર કરવામાં સક્ષમ છે, જે અનુગામી પ્રાયોગિક પરિણામો પરની અસરને મોટા પ્રમાણમાં ઘટાડે છે.

ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ RT અને qPCR સિસ્ટમ્સ વધુ કાર્યક્ષમ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન, વિશિષ્ટતા અને મજબૂત RT-qPCR પ્રતિક્રિયા અવરોધક સહિષ્ણુતા સાથે બે-પગલાં RT-PCRને સક્ષમ કરે છે.

કીટ એપ્લિકેશન

એપ્લિકેશનનો અવકાશ: સંસ્કારી કોષો.

સેમ્પલ લિસિસ અર્થઘટન કરેલ RNA: માત્ર બે-પગલાં RT-qPCR ટેમ્પલેટ તરીકે વપરાય છે.

કીટનો ઉપયોગ નીચેના હેતુઓ માટે કરી શકાય છે: જનીન નિયમનકારી અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણ, એલીલ પરીક્ષણ, ડ્રગ સ્ક્રીનીંગ વગેરે.

કીટ મર્યાદાઓ

વિસ્તૃત ટુકડાઓ ≤ 300 bp.

કિટ્સનો ઉપયોગ કોષોને તાજી રીતે સંવર્ધન કરવા માટે થાય છે.

ઉત્પાદન ગુણવત્તા નિયંત્રણ

FOREGENE ની ટોટલ ક્વોલિટી મેનેજમેન્ટ સિસ્ટમ અનુસાર, સેલ ડાયરેક્ટ RT-qPCR શ્રેણીની કિટ્સની દરેક બેચની કિટની દરેક બેચની ગુણવત્તાની વિશ્વસનીયતા અને સ્થિરતાને સુનિશ્ચિત કરવા માટે ઘણી વખત સખત રીતે પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે.

કીટ સમાવિષ્ટો

*:સેલ લિસિસ, 5×ડાયરેક્ટ RT મિક્સ, 2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-ટાકમેન અલગથી ખરીદી શકાય છે, વિગતો પરિશિષ્ટ 1 (પૃષ્ઠ 13) માં આપવામાં આવી છે.

સંગ્રહ શરતો

1. શિપિંગ શરતો

કિટ <4 °C સ્થિતિમાં છે તેની ખાતરી કરવા માટે નીચા તાપમાને આઇસ પેક બોક્સ પરિવહનની સમગ્ર પ્રક્રિયા.

2. સ્ટોરેજ શરતો

ભાગ I 4°C અને ભાગ II -20°C પર સ્ટોર કરો.

ફોરજીન પ્રોટીઝ પ્લસ II 4°C પર સંગ્રહિત થવો જોઈએ, -20°C પર સ્થિર નહીં.

રીએજન્ટ 2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-ટાકમેન -20 ° સે, અથવા જો વારંવાર ઉપયોગ કરવામાં આવે તો (10 દિવસની અંદર) ટૂંકા ગાળાના ઉપયોગ માટે 4° સે પર સંગ્રહિત થાય છે.

કિટ ઘટક માહિતી

બફર CL: સેલ લિસિસ પ્રતિક્રિયાઓ માટે જરૂરી વાતાવરણ પૂરું પાડે છે.

બફર ST: અનુગામી RT પર અસરો ટાળવા માટે lysate માં સક્રિય પદાર્થને સમાપ્ત કરે છે.

ડીએનએ ઇરેઝર: ડીએનએ રીમુવર, અનુગામી પ્રયોગો પર જીનોમ દૂર કરવાની અસર.

5× ડાયરેક્ટ RT મિક્સ: ઉચ્ચ RNA એફિનિટી ફોરજીન રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ, RNase ઇન્હિબિટર, dNTPs, સ્ટેબિલાઇઝર્સ, એન્હાન્સર્સ, ઑપ્ટિમાઇઝર્સ અને શ્રેષ્ઠ ગોઠવણી માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રાઇમર્સ ધરાવે છે (રેન્ડમ પ્રાઈમર, ઓલિગો(ડીટી)₁₈પ્રાઈમર).

ફોરજીન પ્રોટીઝ પ્લસ II: લિસિસ બફરના સંદર્ભમાં, કોષોને ન્યુક્લિક એસિડ છોડવા માટે લિઝ કરવામાં આવે છે.

2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-ટાકમેન: આ રીએજન્ટમાં હોટ D-Taq DNA પોલિમરેઝ, dNTPs, MgCl હોય છે₂, પ્રતિક્રિયા બફર, PCR ઑપ્ટિમાઇઝર, અને સ્ટેબિલાઇઝર.

20× ROX સંદર્ભ ડાય: સામાન્ય રીતે ABI, Stratagene અને અન્ય કંપનીઓના રિયલ ટાઈમ PCR એમ્પ્લીફિકેશન ઈન્સ્ટ્રુમેન્ટ્સ પર ઉપયોગમાં લેવાય છે, તેનો ઉપયોગ PCR ડોઝિંગ ભૂલોને કારણે થતા PCR ટ્યુબ અને ટ્યુબ વચ્ચેના તફાવતને સમાયોજિત કરવા માટે થાય છે.વિવિધ સાધનો માટે જરૂરી 20× ROX સંદર્ભ ડાય સાંદ્રતા અલગ છે, અને વપરાશકર્તા તેને સાધનની ભલામણ કરેલ સાંદ્રતા અનુસાર ઉમેરી શકે છે.

RNase-મુક્ત ddH₂O: બે-સ્ટેપ RT-qPCR પ્રતિક્રિયાઓ માટે RNase-મુક્ત જંતુરહિત અલ્ટ્રા શુદ્ધ પાણી.

સાવચેતીનાં પગલાં:(કીટનો ઉપયોગ કરતા પહેલા સાવચેતીઓ કાળજીપૂર્વક વાંચવાની ખાતરી કરો)

નમૂનાઓ વચ્ચે ક્રોસ-પ્રદૂષણ ટાળવા માટે પ્રયોગની ઑપરેશન પદ્ધતિ પર ધ્યાન આપો.

RNase દૂષણ અને RNA ડિગ્રેડેશન ટાળવા માટે પ્રાયોગિક વાતાવરણ અને વાસણોની સ્વચ્છતા પર ધ્યાન આપો.

તાજા અથવા સારી રીતે સચવાયેલા કોષના નમૂનાઓ લો અને વારંવાર ફ્રીઝ-પીગળેલા કોષના નમૂનાઓનો ક્યારેય ઉપયોગ કરશો નહીં.

5× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ,2× ડાયરેક્ટ qPCR મિક્સ-ટાકમેન વારંવાર ફ્રીઝ-થૉ ટાળવા જોઈએ, અન્યથા તે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને PCR કાર્યક્ષમતાને અસર કરશે.

પ્રિપારાશનપહેલાંકામગીરી

આ કીટનો ઉપયોગ કરતા પહેલા સૂચનાઓને કાળજીપૂર્વક વાંચવાની ખાતરી કરો.સેલ ડાયરેક્ટ RT-qPCR કિટ સરળ, અનુકૂળ અને ચલાવવા માટે ઝડપી છે, અને સૂચનાઓ સમગ્ર કિટ વિશે અને તેનો યોગ્ય રીતે ઉપયોગ કેવી રીતે કરવો તે વિશે સંપૂર્ણ માહિતી પ્રદાન કરે છે.કૃપા કરીને ઉપયોગ કરતા પહેલા જરૂરી પ્રાયોગિક સામગ્રી અને સાધનો તૈયાર કરો.

પ્રાયોગિક સામગ્રી અને સાધનો

◆ સંસ્કૃતિ કોષો.

◆ 1.5 ml અથવા 2 ml, RNase-/DNase-ફ્રી સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ, RNase-/DNase-ફ્રી ટીપ, 0.2 ml જંતુરહિત qPCR ટ્યુબ.

◆ qPCR મશીન, પીપેટ, ટેબલટોપ સેન્ટ્રીફ્યુજ (≥13,400 છે×g) (પ્રયોગાત્મક જરૂરિયાતો પર આધાર રાખીને), વગેરે.

સલામતી

◆ આ ઉત્પાદન માત્ર વૈજ્ઞાનિક સંશોધન હેતુઓ માટે છે, કૃપા કરીને તેનો ઉપયોગ ફાર્માસ્યુટિકલ, ક્લિનિકલ, ફૂડ અને કોસ્મેટિક હેતુઓ માટે કરશો નહીં.

◆ રસાયણોનો ઉપયોગ કરતી વખતે, યોગ્ય પ્રયોગશાળાના કપડાં, મોજા, રક્ષણાત્મક ચશ્મા વગેરે પહેરો.

ઓપરેશનમાર્ગદર્શિકાઓ

પરિશિષ્ટ 1 (પૃષ્ઠ 13) માં વિગતો માટે સેલ લિસિસ સિસ્ટમ્સ, આરટી સિસ્ટમ્સ અને qPCR પ્રતિક્રિયા ઉકેલ પૂરક પેક અલગથી ખરીદી શકાય છે.

ઓપરેશન માર્ગદર્શિકા

A: નમૂના RNA પ્રકાશન

1.કોષોને પ્રીટ્રીટેડ કરવામાં આવ્યા હતા: કોલ્ડ પીબીએસ વડે સેલ કલ્ચર પ્લેટને ધોઈ લો, પછી કોષોને લીસ કરો (10-10⁶), 10⁶ કોષોની માત્રા કરતાં, આરએનએ નિષ્કર્ષણ અને શુદ્ધિકરણ માટે ફોરજીન ધ સેલ અને આરએનએ આઇસોલેશન કિટ ધ ટોટલ (DE-03111) અથવા એનિમલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કિટ (DE-03011)ની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

1.1.અનુકૂલનશીલ કોષો (ઉદાહરણ તરીકે 24- સારી પ્લેટ)

1.1.1.દરેક કૂવામાં કોષોની સંખ્યા નક્કી કરો, નક્કી કરો કે કોષોની સંખ્યા 1 × 10 છે⁵, અને કલ્ચર ડીશમાંથી કલ્ચર મીડીયમને દૂર કરવા માટે પીપેટનો ઉપયોગ કરો.

1.1.2.દરેક કૂવામાં 200 μl પ્રી-ચીલ્ડ 1 × PBS ઉમેરો.વારંવાર પાઈપ ન કરો અને કુવાઓમાંથી PBS દૂર કરો.પ્લેટને ટિલ્ટ કરો અને શક્ય તેટલું PBS દૂર કરો.પગલું 2 પર આગળ વધો.

1.1.3.સેલ કલ્ચર ડીશમાં વિવિધ સેલ કલ્ચર ડીશ અથવા રેફરન્સ નંબર ટેબલ 1-1 કોષ ધોવા માટે પ્રીકૂલ્ડ 1 × PBS ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.

કોષ્ટક1-1: કોષોની વિવિધ સંખ્યાઓ માટે PBS ડોઝ

નૉૅધ：એક પેઢી પાલન કોષો ખાતરી કરવા માટે,જ્યારે ધોતી વખતે મોટી સંખ્યામાં કોષનું નુકશાન ટાળ્યું હતું.

1.2.બિન-છિદ્રાળુ પ્લેટોમાં સંવર્ધિત સસ્પેન્શન કોશિકાઓ અથવા અનુયાયી કોષો

1.2.1.બિન-મલ્ટી વેલ પ્લેટમાં સંવર્ધિત આનુષંગિક કોષો (સસ્પેન્શન કોષો આગલા પગલા 1.2.2 થી શરૂ થાય છે), સામાન્ય કોષ સંગ્રહ પદ્ધતિ અનુસાર કોષોને એકત્રિત કરો અને અલગ કરો, અને તેમને કલ્ચર પ્લેટ અથવા સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં મૂકો;જો ટ્રિપ્સિનાઇઝેશનનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો, કોષોને એકત્રિત કરવા અને અવશેષ ટ્રિપ્સિનને દૂર કરવા માટે સેન્ટ્રીફ્યુગેશનની જરૂર પડે છે, કોષોને વિખેરવા માટે વ્યક્તિગત કોષોમાં પીબીએસ રિસસ્પેન્ડેડ કોષો ઉમેરે છે.

1.2.2.કોષોની સંખ્યાની ગણતરી કર્યા પછી, કોષો 1×10 અલિકોટ કર્યા⁵ એક થી સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ સુધી, 10 મિનિટ માટે 1000 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કોષો એકત્રિત કરો.

1.2.3.સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં 200 μl PBS ઉમેરો, વારંવાર પાઈપેટ કરશો નહીં અને PBS ને સીધું જ એસ્પિરેટ કરો.પગલું 2 પર આગળ વધો. (જો અવક્ષેપ કરવો મુશ્કેલ હોય અને કોષો ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હોય, તો સુપરનેટન્ટને કાઢી નાખ્યા પછી 10 મિનિટ પછી 1000×g સેન્ટ્રીફ્યુઝ કરી શકાય છે, સેલ પેલેટ પગલું 2 પર આગળ વધે છે)

2.સેલ લિસિસ: બફર CL દૂર કરો, તેનું તાપમાન ઓરડાના તાપમાને સમતુલિત, ડીએનએ ઇરેઝર અને ફોરજીન પ્રોટીઝ પ્લસ II, નીચેના કોષ્ટક 1-2 તૈયાર લિસિસ સિસ્ટમ અનુસાર: (લિસિસ સોલ્યુશન ઉપયોગ માટે તૈયાર છે).

કોષ્ટક 1-2: ક્લીવેજ સિસ્ટમ તૈયારી (નોંધ: બરફ પરની તૈયારીમાં)

3.(ઉદાહરણ તરીકે 24 -વેલ પ્લેટ) દરેક કૂવામાં 200 μl સેલ લિસિસ માસ્ટર મિક્સ કરો, વારંવાર 5-10 વાર ફૂંકાવો, ઓરડાના તાપમાને (20-25 ℃) 5 મિનિટ માટે ઉકાળો.

નૉૅધ：પરપોટાના નિર્માણને ટાળવા માટે, કૃપા કરીને જ્યારે પાઈપિંગ પાઈપેટ સ્કેલને 200μl અથવા તેનાથી ઓછામાં સમાયોજિત કરવામાં આવે.લિસિસ પછી કોષો વાદળછાયું દેખાઈ શકે છે, જે સામાન્ય છે.

4.(ઉદાહરણ તરીકે 24 -વેલ પ્લેટ) પ્રવાહી 20 μl બફર એસટીમાં ઉમેરવામાં આવે છે (કોષ્ટક 1-3માં દર્શાવેલ રકમમાં વિવિધ લિસિસ સિસ્ટમ્સ બફર એસટી ઉમેરવામાં આવે છે), 5-10 વખત પુનરાવર્તિત પાઇપિંગ, ઓરડાના તાપમાને (20-25 ℃) 2 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવે છે.

નૉૅધ：પીપેટની ટોચ સપાટીની નીચે નિકાલ કરવામાં આવે છે, ખાતરી કરે છે કે લિસેટ ઉમેરવામાં આવ્યું છે,પરપોટાના નિર્માણને ટાળવા માટે, કૃપા કરીને જ્યારે પાઇપિંગ પાઇપેટ સ્કેલને 200μl અથવા તેનાથી ઓછા પર ગોઠવવામાં આવે.

કોષ્ટક 1-3：બફર એસટી ઉમેરો

5. લાયસેટનો ઉપયોગ અનુગામી RT-qPCR પ્રયોગો માટે થાય છે.જો અનુગામી પ્રયોગો સમયસર કરી શકાતા નથી, તો કૃપા કરીને તેને 2 કલાકથી વધુ સમય માટે બરફ પર રાખો અને -20 ℃ અથવા -80 ℃ (ત્રણ મહિનાથી વધુ નહીં) પર સ્ટોર કરો.

B: RT સિસ્ટમની તૈયારી

1.5 × ડાયરેક્ટ આરટી મિક્સ લો અને તેને બરફના સ્નાન પર મૂકો, તેને કુદરતી રીતે ઓગળવા દો અને પછીના ઉપયોગ માટે તેને હળવા હાથે મિક્સ કરો;RNase-ફ્રી ddH2O ને બહાર કાઢો અને તેને પીગળી દો અને પછીના ઉપયોગ માટે તેને બરફના સ્નાન પર મૂકો.નીચે આપેલ કોષ્ટક 2-1 મુજબ બરફ પર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી તૈયાર કરો.

કોષ્ટક 2-1: RT પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની તૈયારી

2.સિસ્ટમ ફોર્મ્યુલેશન પૂર્ણ થયા પછી, નીચેના કોષ્ટકમાં સંક્ષિપ્તમાં હળવેથી મિશ્રિત અને સેન્ટ્રીફ્યુજ 2 -2 પ્રતિક્રિયા સ્થિતિ RT પ્રતિક્રિયા.

કોષ્ટક 2-2: RT પ્રતિક્રિયા સ્થિતિ સેટિંગ

3.પ્રતિક્રિયા પૂર્ણ થયા પછી, પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદન qPCR માટે સીધા બરફ પર મૂકવામાં આવ્યું હતું, કૃપા કરીને લાંબા ગાળાની જાળવણી -20℃ અથવા -80 ℃ મૂકો.

નોંધ: બિન-શુદ્ધ ટેમ્પ્લેટના ઉપયોગને લીધે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રોડક્ટમાં સફેદ અવક્ષેપ દેખાઈ શકે છે.આ એક સામાન્ય ઘટના છે.અનુગામી પ્રયોગો માટે તરત જ સુપરનેટન્ટને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરો.

પરિણામી RT રિએક્શન સોલ્યુશનને આગલા સ્ટેપ રિયલ ટાઈમ પીસીઆર રિએક્શન સિસ્ટમ્સમાં ઉમેરવામાં આવે છે, રિએક્શન સિસ્ટમના 10-30% સુધીની માત્રા ઉમેરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે.

સી: qPCR પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ તૈયારી

1. પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી તૈયાર કરવા માટે નીચેના કોષ્ટક 3-1 અનુસાર સ્ટેપ cDNA ટેમ્પલેટમાં તૈયાર કરેલ B ની યોગ્ય માત્રા.

નોંધ: qPCR સિસ્ટમના 10-30% માટે cDNA ટેમ્પલેટનો હિસ્સો છે.ઉદાહરણ તરીકે, 20μl qPCR સિસ્ટમમાં, 2-6 μl લિસિસ બફર ઉમેરો, પરંતુ 6 μl કરતાં વધુ નહીં.

2. qPCR પ્રતિક્રિયા માટે ઑપ્ટિમાઇઝેશન સારી qPCR શરતો (એનીલિંગ તાપમાન, વગેરે).

નોંધ: વધુ સારા પરિણામો મેળવવા માટે qPCR પ્રતિક્રિયાઓ માટે ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ શરતોનો ઉપયોગ કરવાનો પ્રયાસ કરો.

કોષ્ટક 3-1: પીસીઆર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીની તૈયારી

1*: જ્યારે પ્રાઈમર પ્રતિક્રિયા કામગીરી નબળી હોય ત્યારે પ્રાઈમર સાંદ્રતાને 50-900 nM ની રેન્જમાં એડજસ્ટ કરી શકાય છે.

નોંધ: qPCR સિસ્ટમને પ્રાયોગિક જરૂરિયાતો અને ફ્લોરોસેન્સ સાયકલ મોડલ અનુસાર એડજસ્ટ કરી શકાય છે.50 માં qPCR માટેμl સિસ્ટમ, 20 અનુસાર પ્રમાણસર રીએજન્ટ ડોઝને સમાયોજિત કરોμએલ સિસ્ટમ.

2*: ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક થર્મલ સાયકલર અનુસાર ROX સંદર્ભ ડાયની યોગ્ય અંતિમ સાંદ્રતા પસંદ કરો.સામાન્ય ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક સાયકલર્સ માટે સૌથી યોગ્ય ROX સંદર્ભ ડાય સાંદ્રતા નીચેના કોષ્ટકમાં બતાવવામાં આવી છે:

કોષ્ટક 3-2: qPCR પ્રતિક્રિયા શરતો પ્રદાન કરવામાં આવી છે

નોંધ: શ્રેષ્ઠ qPCR ઇફેક્ટ મેળવવા માટે, ગ્રેડિયન્ટ PCR નો ઉપયોગ વિવિધ ટેમ્પ્લેટ્સ અને વિવિધ પ્રાઇમર્સ માટે પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે કરી શકાય છે.ફ્લોરોસેન્સ વિશ્લેષક, ટેમ્પલેટ, પ્રાઈમર વગેરેના આધારે પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિઓ બદલાય છે. ચોક્કસ કામગીરીમાં, શ્રેષ્ઠ પ્રતિક્રિયાની પરિસ્થિતિઓને ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક થર્મલ સાયકલ, નમૂનાનો પ્રકાર, રસના ટુકડાનું કદ, એમ્પ્લીફાઈડનો આધાર ક્રમ, એમ્પ્લીફાઈડ ફ્રેગમેન્ટ અને પ્રાઇમ ફ્રેગમેન્ટની લંબાઈ સહિત તાપમાન અને પ્રતિક્રિયાના સમયની લંબાઈ, ફ્લોરોસેન્સ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​થર્મલ સાયકલની ચોક્કસ પરિસ્થિતિઓ અનુસાર ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે.

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર પ્રાઇમર ડિઝાઇન સિદ્ધાંતો

ફોરવર્ડ પ્રાઈમર અને રિવર્સ પ્રાઈમર

રીયલ ટાઈમ પીસીઆર માટે, પ્રાઈમર ડીઝાઈન ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.પ્રાઇમર્સ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનની વિશિષ્ટતા અને કાર્યક્ષમતા સાથે સંબંધિત છે, અને નીચેના સિદ્ધાંતોના સંદર્ભમાં ડિઝાઇન કરી શકાય છે:

◆ પ્રાઈમર લંબાઈ: 18-30bp.

◆ GC સામગ્રી: 40-60%.

◆ Tm મૂલ્ય: પ્રાઈમર ડિઝાઇન સોફ્ટવેર, જેમ કે પ્રાઈમર 5, પ્રાઈમરનું Tm મૂલ્ય આપી શકે છે.અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઈમર્સના Tm મૂલ્યો શક્ય તેટલા નજીક હોવા જોઈએ.Tm ગણતરી સૂત્રનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR કરતી વખતે, 5 °C ના પ્રાઈમર Tm મૂલ્યથી નીચેનું તાપમાન સામાન્ય રીતે એનેલિંગ તાપમાન તરીકે પસંદ કરવામાં આવે છે (એનીલિંગ તાપમાનમાં અનુરૂપ વધારો PCR પ્રતિક્રિયાની વિશિષ્ટતામાં વધારો કરી શકે છે).

◆ પ્રાઇમર્સ અને પીસીઆર ઉત્પાદનો:

◆ ડિઝાઈન પ્રાઈમર PCR એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટ લંબાઈ પ્રાધાન્ય 100-150bp છે.

◆ ટેમ્પલેટના ગૌણ માળખાકીય વિસ્તારમાં ડિઝાઇન પ્રાઇમર્સ શક્ય તેટલું ટાળવું જોઈએ.

◆ અપસ્ટ્રીમ અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રાઈમર્સના 3′ છેડા વચ્ચે 2 અથવા વધુ પૂરક પાયાના નિર્માણને ટાળો.

◆ પ્રાઈમર 3′ ટર્મિનલ બેઝ 3 વધારાના સળંગ G અથવા C સાથે હાજર હોઈ શકતું નથી.

◆ પ્રાઈમર્સમાં પૂરક માળખું હોઈ શકતું નથી, અન્યથા હેરપિન સ્ટ્રક્ચર બનાવવામાં આવશે, જે PCR એમ્પ્લીફિકેશનને અસર કરશે.

◆ ATCG પ્રાઈમર ક્રમમાં શક્ય તેટલી સમાનરૂપે વિતરિત થવી જોઈએ, અને 3′ ટર્મિનલ બેઝને T તરીકે ટાળવું જોઈએ.

પરિશિષ્ટ1：Cએલ ડાયરેક્ટRT-qPCR કીટ ઘટકોટી પૂરક પેક

1.સેલ લિસિસ સોલ્યુશન