1. પ્રારંભિક સમજ

આ તબક્કે, આપણે કેટલાક ખ્યાલો અને પરિભાષા સમજવાની જરૂર છે, જેથી કરીને અમારા વરિષ્ઠોની સામે ભૂલો કરવાનું ટાળી શકાય, જેમ કે:

પ્ર: RT-PCR, qPCR, રિયલ-ટાઇમ PCR અને રિયલ-ટાઇમ RT-PCR વચ્ચે શું તફાવત છે?

જવાબ: RT-PCR એ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન PCR છે(રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પીસીઆર, આરટી-પીસીઆર), જે પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (પીસીઆર) નો વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતો પ્રકાર છે.આરટી-પીસીઆરમાં, આરએનએ સ્ટ્રાન્ડને પૂરક ડીએનએમાં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવામાં આવે છે, જે પછી પીસીઆર દ્વારા ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન માટે નમૂના તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે.
રીઅલ-ટાઇમ-PCR અને qPCR(ક્વોન્ટિટેટિવ ​​Rea-ltime-PCR) એ એક જ વસ્તુ છે, બંને રીઅલ-ટાઇમ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર છે, જેનો અર્થ છે કે પીસીઆરના દરેક ચક્રમાં રીઅલ-ટાઇમ ડેટા રેકોર્ડ્સ છે, તેથી પ્રારંભિક નમૂનાઓની સંખ્યાને ચોક્કસ વિશ્લેષણ ગોઠવી શકાય છે.

જોકે રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર (રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર) અને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પીસીઆર (રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પીસીઆર) બંનેને આરટી-પીસીઆર તરીકે સંક્ષિપ્તમાં દર્શાવવામાં આવે છે, આંતરરાષ્ટ્રીય સંમેલન છે: આરટી-પીસીઆર ખાસ કરીને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનનો સંદર્ભ આપે છે.પીસીઆર , રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર સામાન્ય રીતે qPCR (ક્વોન્ટિટેટિવ ​​રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર) તરીકે સંક્ષિપ્ત છે..

અને રીઅલ-ટાઇમ RT-PCR (RT-qPCR), તે ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​ટેકનોલોજી સાથે જોડાયેલ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પીસીઆર છે.: પહેલા RNA રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનમાંથી cDNA (RT) મેળવો અને પછી જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ (qPCR) માટે રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆરનો ઉપયોગ કરો.મોટાભાગની પ્રયોગશાળાઓ RT-qPCR કરે છે, એટલે કે, RNA અભિવ્યક્તિ ડાઉન-રેગ્યુલેશન પર સંશોધન કરે છે, તેથી પ્રયોગશાળામાં દરેક વ્યક્તિ જે qPCR વિશે વાત કરે છે તે વાસ્તવમાં RT-qPCR નો સંદર્ભ આપે છે, પરંતુ ભૂલશો નહીં કે ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન્સમાં હજુ પણ ઘણા DNA પરીક્ષણો છે.માત્રાત્મક વિશ્લેષણ, જેમ કે હેપેટાઇટિસ B વાયરસ HBV શોધ.

પ્રશ્ન: ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆરને ઘણું વાંચ્યા પછી, શા માટે એમ્પ્લીફાઈડ ફ્રેગમેન્ટને 80-300bp ની રેન્જમાં નિયંત્રિત કરવું જોઈએ?

જવાબ આપો: દરેક જનીન ક્રમની લંબાઈ જુદી જુદી હોય છે, કેટલાક ઘણા kb હોય છે, કેટલાક સેંકડો bp હોય છે, પરંતુ અમારે પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરતી વખતે ઉત્પાદનની લંબાઈ માત્ર 80-300bp હોવી જરૂરી છે, ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR શોધ માટે ખૂબ ટૂંકા અથવા ખૂબ લાંબા યોગ્ય નથી.ઉત્પાદનનો ટુકડો પ્રાઈમર-ડાઈમરથી અલગ પાડવા માટે ખૂબ નાનો છે.પ્રાઈમર-ડાઈમરની લંબાઈ લગભગ 30-40bp છે, અને જો તે 80bp કરતા ઓછી હોય તો તે પ્રાઈમર-ડાઈમર છે કે પ્રોડક્ટ છે તે ઓળખવું મુશ્કેલ છે.જો ઉત્પાદનનો ટુકડો ખૂબ લાંબો હોય, 300bp કરતાં વધી જાય, તો તે સરળતાથી નીચી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા તરફ દોરી જશે અને જનીનની માત્રાને અસરકારક રીતે શોધી શકશે નહીં.

ઉદાહરણ તરીકે, જ્યારે તમે ગણો છો કે વર્ગખંડમાં કેટલા લોકો છે, ત્યારે તમારે માત્ર કેટલા મોં છે તે ગણતરી કરવાની જરૂર છે.તે જ સાચું છે જ્યારે તમે જનીનોને શોધી કાઢો છો, તમારે માત્ર એક જનીનનો ચોક્કસ ક્રમ શોધવાની જરૂર છે જે સમગ્ર ક્રમને રજૂ કરશે.જો તમે લોકોની ગણતરી કરવા માંગતા હો, તો તમારે મોં અને નાક, કાન અને ચશ્મા બંનેની ગણતરી કરવાની જરૂર છે, અને ભૂલ કરવી સરળ છે.

વિસ્તરણ કરવા માટે, જૈવિક સંશોધનમાં, બિંદુથી વિસ્તાર સુધી ઘણા સંશોધનના કિસ્સાઓ છે, કારણ કે કોઈપણ પ્રજાતિનો જનીન ક્રમ ઘણો લાંબો હોય છે, બેક્ટેરિયા 16S સિક્વન્સિંગ જેવા તમામ ટુકડાઓ માપવા બિનજરૂરી અને અશક્ય છે, જે બેક્ટેરિયાના રૂઢિચુસ્ત ક્રમને હાથ ધરવા માટે ચોક્કસ સંખ્યાની સંખ્યાને અનુમાનિત કરવા માટે બેક્ટેરિયાના મૂલ્યાંકન કરે છે.

પ્ર: qPCR પ્રાઈમર ડિઝાઇન માટે શ્રેષ્ઠ લંબાઈ કેટલી છે?

જવાબ આપો: સામાન્ય રીતે કહીએ તો, પ્રાઈમરની લંબાઈ લગભગ 20-24bp છે, જે વધુ સારી છે.અલબત્ત, પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરતી વખતે આપણે પ્રાઈમરના TM મૂલ્ય પર ધ્યાન આપવું જોઈએ, કારણ કે આ શ્રેષ્ઠ એન્નીલિંગ તાપમાન સાથે સંબંધિત છે.ઘણા બધા પ્રયોગો પછી, તે સાબિત થયું છે કે 60°C એ વધુ સારું TM મૂલ્ય છે.જો એનિલિંગ તાપમાન ખૂબ ઓછું હોય, તો તે સરળતાથી બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જશે.જો એનિલિંગ તાપમાન ખૂબ ઊંચું હોય, તો એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પ્રમાણમાં ઓછી હશે, એમ્પ્લીફિકેશન કર્વની ટોચ પછીથી શરૂ થશે, અને સીટી મૂલ્યમાં વિલંબ થશે.

પ્ર: ડાય પદ્ધતિ તપાસ પદ્ધતિથી કેવી રીતે અલગ છે?

જવાબ: રંગ પદ્ધતિકેટલાક ફ્લોરોસન્ટ રંગો, જેમ કે SYBR ગ્રીન Ⅰ, પીકોગ્રીન, BEBO, વગેરે, પોતાની રીતે પ્રકાશ ઉત્સર્જિત કરતા નથી, પરંતુ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએના નાના ખાંચો સાથે જોડાયા પછી ફ્લોરોસેન્સ ઉત્સર્જન કરશે.તેથી, પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની શરૂઆતમાં, મશીન ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ શોધી શકતું નથી.જ્યારે પ્રતિક્રિયા એનિલિંગ-એક્સ્ટેંશન સ્ટેજ પર પહોંચે છે, ત્યારે ડબલ સ્ટ્રેન્ડ ખોલવામાં આવે છે, અને ડીએનએ પોલિમરેઝની ક્રિયા હેઠળ એક નવી સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ થાય છે, અને ફ્લોરોસન્ટ પરમાણુ dsDNA નાના ગ્રુવ સાથે જોડાય છે.જેમ જેમ પીસીઆર ચક્રની સંખ્યામાં વધારો થાય છે, તેમ તેમ વધુને વધુ રંગો ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ સાથે જોડાય છે, અને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ પણ સતત ઉન્નત થાય છે.રંગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે વૈજ્ઞાનિક સંશોધનમાં થાય છે.
PS: પ્રયોગ કરતી વખતે સાવચેત રહો, રંગને માનવ ડીએનએ સાથે જોડવો જોઈએ, તેને ફ્લોરોસન્ટ વ્યક્તિમાં ફેરવવા માટે સાવચેત રહો.

ડાય પદ્ધતિ (ડાબે) પ્રોબ પદ્ધતિ (જમણે)
PS: પ્રયોગ કરતી વખતે સાવચેત રહો, રંગને માનવ ડીએનએ સાથે જોડવો જોઈએ, તેને ફ્લોરોસન્ટ વ્યક્તિમાં ફેરવવા માટે સાવચેત રહો.

SYBR ગ્રીન Ⅰ DNA ના નાના ખાંચો સાથે જોડાય છે

તપાસ પદ્ધતિતાકમાન પ્રોબ એ સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી હાઇડ્રોલિસિસ પ્રોબ છે.ચકાસણીના 5′ છેડે ફ્લોરોસન્ટ જૂથ છે, સામાન્ય રીતે FAM, અને ચકાસણી પોતે લક્ષ્ય જનીન માટે પૂરક ક્રમ છે.3′ છેડે ફ્લોરોસન્ટ શમન જૂથ છે.ફ્લોરોસેન્સ રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર (Förster રેઝોનન્સ એનર્જી ટ્રાન્સફર, FRET) ના સિદ્ધાંત અનુસાર, જ્યારે રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ (દાતા ફ્લોરોસન્ટ પરમાણુ) અને ક્વેન્ચિંગ ફ્લોરોસન્ટ જૂથ (સ્વીકારક ફ્લોરોસન્ટ પરમાણુ) ઉત્સાહિત હોય છે, જ્યારે સ્પેક્ટ્રા ઓવરલેપ થાય છે અને અંતર ખૂબ જ નજીક હોય છે (મોલેક્યુલેશન) સ્વીકારનાર પરમાણુનું ફ્લોરોસેન્સ, જ્યારે ઓટોફ્લોરોસેન્સ નબળું પડી ગયું છે.તેથી, પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની શરૂઆતમાં, જ્યારે ચકાસણી સિસ્ટમમાં મુક્ત અને અખંડ હોય છે, ત્યારે રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથ ફ્લોરોસેન્સનું ઉત્સર્જન કરશે નહીં.જ્યારે એનેલીંગ કરવામાં આવે છે, ત્યારે પ્રાઈમર અને પ્રોબ ટેમ્પલેટ સાથે જોડાય છે.વિસ્તરણ તબક્કા દરમિયાન, પોલિમરેઝ સતત નવી સાંકળોનું સંશ્લેષણ કરે છે.DNA પોલિમરેઝમાં 5′-3′ exonuclease પ્રવૃત્તિ છે.જ્યારે ચકાસણી સુધી પહોંચે છે, ત્યારે ડીએનએ પોલિમરેઝ ટેમ્પલેટમાંથી પ્રોબને હાઇડ્રોલાઈઝ કરશે, રિપોર્ટર ફ્લોરોસન્ટ જૂથને ક્વેન્ચર ફ્લોરોસન્ટ જૂથથી અલગ કરશે અને ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ છોડશે.ચકાસણી અને ટેમ્પ્લેટ વચ્ચે એક-થી-એક સંબંધ હોવાથી, ચકાસણીની ચોકસાઈ અને સંવેદનશીલતાના સંદર્ભમાં ચકાસણી પદ્ધતિ રંગ પદ્ધતિ કરતાં શ્રેષ્ઠ છે.તપાસ પદ્ધતિનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે નિદાનમાં થાય છે.

પ્ર: સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ શું છે?સંબંધિત પરિમાણ શું છે?

જવાબ આપો: સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ એ qPCR દ્વારા પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાના પ્રારંભિક નકલ નંબરની ગણતરીનો સંદર્ભ આપે છે, જેમ કે રક્તના 1ml માં કેટલા HBV વાયરસ છે.સંબંધિત પરિમાણ દ્વારા પ્રાપ્ત પરિણામ એ અન્ય સંદર્ભ નમૂનાની તુલનામાં ચોક્કસ નમૂનામાં લક્ષ્ય જનીનની માત્રામાં ફેરફાર છે, અને જનીન અભિવ્યક્તિ અપ-રેગ્યુલેટેડ અથવા ડાઉન-રેગ્યુલેટેડ છે.

પ્ર: શું આરએનએ નિષ્કર્ષણની માત્રા, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા પ્રાયોગિક પરિણામોને અસર કરશે?
પ્ર: શું નમૂના સંગ્રહ, નિષ્કર્ષણ રીએજન્ટ્સ, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન રીએજન્ટ્સ અને પ્રકાશ-પ્રસારણ ઉપભોજ્ય વસ્તુઓ પ્રાયોગિક પરિણામોને અસર કરશે?
પ્રશ્ન: કઈ પદ્ધતિ પ્રાયોગિક ડેટાને સુધારી શકે છે?

આ મુદ્દાઓ વિશે, અમે તેમને નીચેના અદ્યતન અને અદ્યતન વિભાગોમાં વિગતવાર વર્ણન કરીશું.
2. અદ્યતન જ્ઞાન

રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆરના સંદર્ભમાં, આપણે વાસ્તવિકતાને ઓળખવી જોઈએ કે દર વર્ષે હજારો વૈજ્ઞાનિક સંશોધન પત્રો પ્રકાશિત થાય છે, જેમાંથી ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર તકનીક નાની સંખ્યા નથી.

જો ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR પ્રયોગને માપવા માટે કોઈ સામાન્ય ધોરણો નથી, તો પરિણામો વ્યાપકપણે બદલાઈ શકે છે.સમાન પ્રજાતિના સમાન જનીન માટે, સમાન પ્રક્રિયા પદ્ધતિ સાથે, શોધ પરિણામો પણ વ્યાપકપણે બદલાશે, અને મોડેથી આવનારાઓ માટે સમાન પરિણામોનું પુનરાવર્તન કરવું મુશ્કેલ બનશે.તમે કોઈ જાણતું નથી કે શું સાચું છે અને શું ખોટું.

શું આનો અર્થ એ છે કે ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર એ ચીટ ટેકનોલોજી છે કે અવિશ્વસનીય ટેકનોલોજી છે?ના, તે એટલા માટે છે કારણ કે ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર વધુ સંવેદનશીલ અને વધુ સચોટ છે, અને થોડું ખોટું ઓપરેશન સંપૂર્ણપણે વિપરીત પરિણામો લાવશે.એક નાની ખોટ હજાર માઈલ દૂર છે.લેખના લેખકને સમીક્ષકો દ્વારા વારંવાર ત્રાસ આપવામાં આવી શકે છે.તે જ સમયે, જર્નલના સમીક્ષકો માટે વિવિધ પ્રાયોગિક પરિણામોમાંથી પસંદ કરવાનું પણ મુશ્કેલ છે.

એકંદરે, રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર પ્રયોગોમાં સર્વસંમતિના અભાવ તરફ નિર્દેશ કરે છે.આ માટે, ઉદ્યોગના વરિષ્ઠ વૈજ્ઞાનિકોએ ધોરણો ઘડવાનું શરૂ કર્યું,આ ધોરણોને પૂર્ણ કરવા માટે યોગદાનકર્તાઓને લેખમાં કેટલીક જરૂરી પ્રાયોગિક અને ડેટા પ્રોસેસિંગ વિગતો (જરૂરી ડેટા સહિત) પ્રદાન કરવાની આવશ્યકતા છે.

સમીક્ષકો આ વિગતો વાંચીને પ્રયોગની ગુણવત્તા નક્કી કરી શકે છે;ભાવિ વાચકો પણ પ્રયોગનું પુનરાવર્તન કરવા અથવા પ્રયોગ સુધારવા માટે આનો ઉપયોગ કરી શકે છે.પછી આ રીતે મેળવેલા પ્રાયોગિક પરિણામો માહિતીથી ભરપૂર, ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા અને ઉપયોગી છે.

MIBBI (જૈવિક અને બાયોમેડિકલ તપાસ માટે ન્યૂનતમ માહિતી -http://www.mibbi.org) અસ્તિત્વમાં આવ્યું.MIBBI એક એવો પ્રોજેક્ટ છે જે પ્રયોગો માટે ધોરણો પૂરા પાડે છે.તે પ્રકૃતિમાં પ્રકાશિત થાય છે.આ પ્રોજેક્ટનો હેતુ સેલ બાયોલોજી, માઇક્રોએરે, qPCR સહિત વિવિધ જૈવિક પ્રયોગોનો છે, જેની આપણે હવે ચર્ચા કરવા જઈ રહ્યા છીએ, વગેરે, અને હસ્તપ્રતો સબમિટ કરતી વખતે દરેક પ્રકારના પ્રયોગ માટે પ્રદાન કરે છે.તે માહિતી દરેક સમયે પ્રદાન કરવી જોઈએ.

MIBBI પ્રોજેક્ટમાં, ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર સંબંધિત બે લેખો છે, એટલે કે:
·આરડીએમએલ (રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર ડેટા માર્કઅપ લેંગ્વેજ) – એક સંરચિત ભાષા અને રીઅલ-ટાઇમ જથ્થાત્મક પીસીઆર ડેટા માટે રિપોર્ટિંગ માર્ગદર્શિકા;
· MIQE (ક્વોન્ટિટેટિવ ​​રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર પ્રયોગોના પ્રકાશન માટેની ન્યૂનતમ માહિતી) – વાસ્તવિક સમયના જથ્થાત્મક પીસીઆર પ્રયોગો વિશે લેખો પ્રકાશિત કરવા માટેની ન્યૂનતમ માહિતી.
પ્રથમ, ચાલો RDML, પરિભાષા સ્પષ્ટીકરણ વિશે વાત કરીએ.

જો દરેક વસ્તુ માટે કોઈ પ્રમાણભૂત વ્યાખ્યા નથી, તો ચર્ચા ચાલુ રાખવી અશક્ય છે, તેથી જ પરીક્ષામાં શરતોની સમજૂતી એટલી મહત્વપૂર્ણ છે.
ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR પ્રયોગમાં વપરાતી પરિભાષામાં નીચેની સામગ્રીનો સમાવેશ થાય છે.QIAGEN એ અમારા માટે શ્રેષ્ઠ સારાંશ બનાવ્યો છે.નીચેના બધા શુષ્ક છેમાલ .

એમ્પ્લીફિકેશન વળાંક
એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ એ પીસીઆર પ્રક્રિયા દરમિયાન બનેલા વળાંકને સંદર્ભિત કરે છે, જેમાં ચક્ર નંબર એબ્સીસા તરીકે અને ઓર્ડિનેટ તરીકે પ્રતિક્રિયા દરમિયાન રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા હોય છે.

ઉત્તમ એમ્પ્લીફિકેશન કર્વમાં નીચેની લાક્ષણિકતાઓ હોવી જોઈએ: આધારરેખા સપાટ છે અથવા થોડી ઘટી છે, અને ત્યાં કોઈ સ્પષ્ટ ઉપરનું વલણ નથી;વળાંકનો ઇન્ફ્લેક્શન બિંદુ સ્પષ્ટ છે, અને ઘાતાંકીય તબક્કાનો ઢોળાવ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા માટે પ્રમાણસર છે.ઢોળાવ જેટલો મોટો, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા વધારે;એકંદર એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ સમાનતા સારી છે, જે દર્શાવે છે કે દરેક ટ્યુબની એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સમાન છે;ઓછી સાંદ્રતાના નમૂનાઓના એમ્પ્લીફિકેશન કર્વનો ઘાતાંકીય તબક્કો સ્પષ્ટ છે.

બેઝલાઇન (બેઝલાઇન)
આધારરેખા એ પ્રારંભિક ચક્રનો અવાજ સ્તર છે, સામાન્ય રીતે 3જી અને 15મી ચક્ર વચ્ચે માપવામાં આવે છે, કારણ કે એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટને કારણે ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્યમાં વધારો આ સમયગાળા દરમિયાન શોધી શકાતો નથી.આધારરેખાની ગણતરી કરવા માટે વપરાતા ચક્રોની સંખ્યા વિવિધ હોઈ શકે છે અને જો ઉચ્ચ નમૂનાની માત્રાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે અથવા જો લક્ષ્ય જનીનનું અભિવ્યક્તિ સ્તર ઊંચું હોય તો તેને ઘટાડવાની જરૂર પડી શકે છે.

બેઝલાઇન સેટ કરવા માટે રેખીયતા એમ્પ્લીફિકેશન કર્વમાંથી ફ્લોરોસેન્સ ડેટા જોવાની જરૂર છે.બેઝલાઈન સેટ કરવામાં આવે છે જેથી એમ્પ્લીફિકેશન કર્વની વૃદ્ધિ બેઝલાઈન સાયકલ ટોપ નંબર કરતા વધુ ચક્ર નંબરથી શરૂ થાય.દરેક લક્ષ્ય ક્રમ માટે આધારરેખાઓ વ્યક્તિગત રીતે સેટ કરવાની જરૂર છે.પ્રારંભિક ચક્રમાં શોધાયેલ સરેરાશ ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્યો એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદનોમાં મેળવેલા ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્યોમાંથી બાદબાકી કરવાની જરૂર છે.વિવિધ રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર સૉફ્ટવેરનાં નવીનતમ સંસ્કરણો વ્યક્તિગત નમૂનાઓ માટે બેઝલાઇન સેટિંગ્સના સ્વચાલિત ઑપ્ટિમાઇઝેશનને મંજૂરી આપે છે.

પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાના પ્રથમ થોડા ચક્ર દરમિયાન, ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ વધુ બદલાતું નથી.સીધી રેખાની નજીક પહોંચવાને આધારરેખા કહેવામાં આવે છે, પરંતુ જો આપણે પ્રથમ થોડા ચક્રો પર નજીકથી નજર કરીએ, તો આપણે જોઈશું કે નીચેના ચિત્રમાં જે થઈ રહ્યું છે તે આધારરેખાની અંદર છે.

પૃષ્ઠભૂમિ પૃષ્ઠભૂમિ ઉલ્લેખ કરે છે
પ્રતિક્રિયામાં બિન-વિશિષ્ટ ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્ય.ઉદાહરણ તરીકે: બિનકાર્યક્ષમ ફ્લોરોસેન્સ શમન;અથવા SYBR ગ્રીનના ઉપયોગને કારણે મોટી સંખ્યામાં ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટેમ્પ્લેટ્સ.સિગ્નલના પૃષ્ઠભૂમિ ઘટકોને રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર સોફ્ટવેર અલ્ગોરિધમ દ્વારા ગાણિતિક રીતે દૂર કરવામાં આવે છે.

રિપોર્ટર સિગ્નલ
રિપોર્ટર સિગ્નલ એ રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર દરમિયાન SYBR ગ્રીન અથવા ફ્લોરોસન્ટલી લેબલવાળી સિક્વન્સ-સ્પેસિફિક પ્રોબ દ્વારા જનરેટ કરાયેલ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલનો સંદર્ભ આપે છે.

સામાન્ય રિપોર્ટર સિગ્નલ (RN)
RN એ દરેક ચક્ર પર માપવામાં આવતા નિષ્ક્રિય સંદર્ભ રંગની ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતા દ્વારા વિભાજિત રિપોર્ટર ડાયની ફ્લોરોસેન્સ તીવ્રતાનો સંદર્ભ આપે છે.

નિષ્ક્રિય સંદર્ભ ડાય
કેટલાક રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆરમાં,ફ્લોરોસન્ટ ડાય ROX નો ઉપયોગ ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલને સામાન્ય બનાવવા માટે આંતરિક સંદર્ભ તરીકે થાય છે.તે અચોક્કસ પાઈપિંગ, સારી સ્થિતિ અને સારી રીતે-સારા ધોરણે ફ્લોરોસેન્સ વધઘટને કારણે ભિન્નતા માટે સુધારે છે.

ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ (થ્રેશોલ્ડ)
પૃષ્ઠભૂમિ મૂલ્યની ઉપર અને એમ્પ્લીફિકેશન કર્વના પ્લેટુ મૂલ્યની નીચે નોંધપાત્ર રીતે સમાયોજિત કરવામાં આવ્યું હતું.તે એમ્પ્લીફિકેશન કર્વના રેખીય પ્રદેશમાં હોવું જોઈએ, જે પીસીઆર શોધની લોગ-રેખીય શ્રેણીનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.થ્રેશોલ્ડ લોગ-એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ વ્યુમાં સેટ થવો જોઈએ જેથી કરીને પીસીઆરનો લોગ-રેખીય તબક્કો સરળતાથી ઓળખી શકાય.જો રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆરમાં બહુવિધ લક્ષ્ય જનીનો હોય, તો દરેક લક્ષ્ય માટે થ્રેશોલ્ડ સેટ હોવું આવશ્યક છે.સામાન્ય રીતે, પીસીઆર પ્રતિક્રિયાના પ્રથમ 15 ચક્રના ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલનો ઉપયોગ ફ્લોરોસેન્સ બેકગ્રાઉન્ડ સિગ્નલ તરીકે થાય છે, અને ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ પીસીઆરના પ્રથમ 3 થી 15 ચક્રના ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલના પ્રમાણભૂત વિચલન કરતાં 10 ગણું હોય છે, અને ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ PCR એમ્પોનિયલ તબક્કામાં સેટ કરવામાં આવે છે.સામાન્ય રીતે, દરેક સાધનનો ઉપયોગ પહેલાં તેની ફ્લોરોસેન્સ થ્રેશોલ્ડ સેટ હોય છે.

સાયકલ થ્રેશોલ્ડ (CT) અથવા ક્રોસિંગ પોઈન્ટ (CP)
ચક્ર કે જેના પર એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ થ્રેશોલ્ડને પાર કરે છે (એટલે ​​​​કે, તે બિંદુ કે જેના પર ફ્લોરોસેન્સ શોધ નોંધપાત્ર રીતે વધે છે).સીટી અપૂર્ણાંક હોઈ શકે છે અને પ્રારંભિક નમૂનાની રકમની ગણતરી કરી શકાય છે.સીટી મૂલ્ય દરેક પીસીઆર પ્રતિક્રિયા ટ્યુબમાં ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલ સેટ થ્રેશોલ્ડ સુધી પહોંચે ત્યારે અનુભવાયેલા ચક્રની સંખ્યા દર્શાવે છે.દરેક નમૂનાના CT મૂલ્ય અને નમૂનાના પ્રારંભિક નકલ નંબરના લઘુગણક વચ્ચે એક રેખીય સંબંધ છે,પ્રારંભિક કોપી નંબર વધારે, CT મૂલ્ય નાનું અને ઊલટું.સ્ટાન્ડર્ડ કર્વ જાણીતા પ્રારંભિક કોપી નંબર સાથેના સ્ટાન્ડર્ડનો ઉપયોગ કરીને બનાવી શકાય છે, જેમાં એબ્સીસા સીટી મૂલ્યનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને ઓર્ડિનેટ પ્રારંભિક નકલ નંબરના લઘુગણકનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.તેથી, જ્યાં સુધી અજાણ્યા નમૂનાનું CT મૂલ્ય પ્રાપ્ત થાય ત્યાં સુધી, નમૂનાના પ્રારંભિક નકલ નંબરની ગણતરી પ્રમાણભૂત વળાંકમાંથી કરી શકાય છે.

ΔCT મૂલ્ય
ΔCT મૂલ્ય વર્ણવે છેલક્ષ્ય જનીન અને અનુરૂપ અંતર્જાત સંદર્ભ જનીન સીટી મૂલ્ય વચ્ચેનો તફાવત, જેમ કે હાઉસકીપિંગ જનીન, અને તેનો ઉપયોગ ટેમ્પલેટની માત્રાને સામાન્ય બનાવવા માટે થાય છે:
⇒ΔCT = CT (લક્ષ્ય જનીન) - CT (અંતર્જાત સંદર્ભ જનીન)

ΔΔCT મૂલ્ય
ΔΔCT મૂલ્ય રુચિના નમૂનાના સરેરાશ ΔΔCT મૂલ્ય (દા.ત., ઉત્તેજિત કોષો) અને સંદર્ભ નમૂનાના સરેરાશ ΔΔCT મૂલ્ય (દા.ત., અનસ્ટિમ્યુલેટેડ કોષો) વચ્ચેના તફાવતનું વર્ણન કરે છે.સંદર્ભ નમૂનાને માપાંકન નમૂના પણ કહેવામાં આવે છે અને અન્ય તમામ નમૂનાઓ સંબંધિત પરિમાણ માટે આના માટે સામાન્ય કરવામાં આવે છે:
⇒ΔΔCT = સરેરાશ ΔCT (રસનો નમૂનો) - સરેરાશ ΔCT (સંદર્ભ નમૂના)

અંતર્જાત સંદર્ભ જનીનો (અંતજાત સંદર્ભ જનીનો)
અંતર્જાત સંદર્ભ જનીનોના અભિવ્યક્તિ સ્તરો, જેમ કે હાઉસકીપીંગ જનીનો (હાઉસકીપીંગ જીન્સ), નમૂનાઓ વચ્ચે ભિન્ન નથી.સંદર્ભ જનીનનાં સીટી મૂલ્યોની લક્ષ્ય જનીન સાથે સરખામણી કરવાથી લક્ષ્ય જનીનનાં અભિવ્યક્તિ સ્તરને ઇનપુટ આરએનએ અથવા સીડીએનએ (ઉપરના ΔCT મૂલ્યો પરનો વિભાગ જુઓ) ની માત્રાને સામાન્ય બનાવવાની મંજૂરી આપે છે.

માટે આંતરિક સંદર્ભ જનીનો યોગ્ય છેશક્ય આરએનએ અધોગતિ અથવા આરએનએ નમૂનાઓમાં એન્ઝાઇમ અવરોધકોની હાજરી, તેમજ આરએનએ સામગ્રીમાં ભિન્નતા, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા, ન્યુક્લીક એસિડ પુનઃપ્રાપ્તિ અને નમૂનાનું સંચાલન.શ્રેષ્ઠ સંદર્ભ જનીન પસંદ કરવા માટે, અમે પ્રાયોગિક સેટિંગ પર આધારિત શ્રેષ્ઠ સંદર્ભની પસંદગીને મંજૂરી આપવા માટે અલ્ગોરિધમમાં ફેરફાર કર્યો છે.

આંતરિક નિયંત્રણ
એક નિયંત્રણ ક્રમ કે જે લક્ષ્ય ક્રમની સમાન પ્રતિક્રિયામાં વિસ્તૃત થાય છે અને અલગ ચકાસણી સાથે તપાસવામાં આવે છે (એટલે ​​​​કે, ડુપ્લેક્સ પીસીઆર કરે છે).આંતરિક નિયંત્રણોનો ઉપયોગ નિષ્ફળ એમ્પ્લીફિકેશનને નકારી કાઢવા માટે કરવામાં આવે છે, જેમ કે જ્યારે લક્ષ્ય ક્રમ શોધાયેલ નથી.
માપાંકન નમૂના
સંદર્ભ નમૂના (ઉદાહરણ તરીકે, કોષ રેખા અથવા પેશીઓમાંથી શુદ્ધ થયેલ આરએનએ) સંબંધિત જનીનનું સંબંધિત અભિવ્યક્તિ સ્તર નક્કી કરવા માટે અન્ય તમામ નમૂનાઓની તુલના કરવા માટે સંબંધિત પરિમાણમાં વપરાય છે.માપાંકન નમૂના કોઈપણ નમૂના હોઈ શકે છે, પરંતુ તે સામાન્ય રીતે નિયંત્રણ હોય છે (ઉદાહરણ તરીકે, સારવાર ન કરાયેલ નમૂનો અથવા પ્રયોગના શૂન્ય સમયનો નમૂનો).

હકારાત્મક નિયંત્રણો
સાથે નિયંત્રણ પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરોનમૂનાની જાણીતી માત્રા.પ્રાઈમર સેટ અથવા પ્રાઈમર-પ્રોબ સેટ યોગ્ય રીતે કામ કરી રહ્યો છે અને પ્રતિક્રિયા યોગ્ય રીતે સેટ થઈ છે તે ચકાસવા માટે સકારાત્મક નિયંત્રણોનો ઉપયોગ વારંવાર કરવામાં આવે છે.

નો ટેમ્પલેટ કંટ્રોલ (NTC)
એક નિયંત્રણ પ્રતિક્રિયા જેમાં ટેમ્પલેટ સિવાય એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાના તમામ જરૂરી ઘટકો હોય છે, જે સામાન્ય રીતે પાણીથી બદલાય છે.એનટીસીનો ઉપયોગ રીએજન્ટ દૂષણ અથવા વિદેશી ડીએનએ દ્વારા થતા દૂષણને શોધી શકે છે, આમ ડિટેક્શન ડેટાની અધિકૃતતા અને વિશ્વસનીયતા સુનિશ્ચિત કરે છે.NTC નિયંત્રણનું એમ્પ્લીફિકેશન દૂષિતતા સૂચવે છે.

કોઈ RT નિયંત્રણ નથી (NRT)
આરએનએ નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયામાં શેષ જીનોમિક ડીએનએ હોઈ શકે છે, જે અત્યંત હાનિકારક છે અને તે ડેટાની ગુણવત્તાને અસર કરતી ગુનેગાર છે અને qPCR ના કુદરતી દુશ્મન છે, તેથી પ્રયોગો ડિઝાઇન કરતી વખતે, તે માત્ર આરએનએ શોધને વિસ્તૃત કરવા માટે રચાયેલ હોવું જોઈએ.ત્યાં બે રીતો છે, એક છે ઇન્ટ્રોન્સમાં પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવાનો, બીજો ડીએનએને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવાનો છે, જે એક વધુ સારું છે, જેની પછીથી ચર્ચા કરવામાં આવશે.એનટીઆર કંટ્રોલ એ ડીએનએ પ્રદૂષણને શોધવા માટે એક જાદુઈ અરીસો છે.જો ત્યાં એમ્પ્લીફિકેશન છે, તો તેનો અર્થ એ છે કે ત્યાં પ્રદૂષણ છે.

ધોરણો
ધોરણો જાણીતી સાંદ્રતા અથવા નકલ નંબરના નમૂનાઓ છે જેનો ઉપયોગ પ્રમાણભૂત વળાંક બાંધવા માટે થાય છે.સ્ટાન્ડર્ડની સ્થિરતાને સુનિશ્ચિત કરવા માટે, જનીન ટુકડો સામાન્ય રીતે પ્લાઝમિડમાં ક્લોન કરવામાં આવે છે અને ધોરણ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે.

પ્રમાણભૂત વળાંક
સામાન્ય રીતે બમણા ગુણોત્તર અનુસાર પ્રમાણભૂત ઉત્પાદન સાથે ઓછામાં ઓછા 5 એકાગ્રતા ગ્રેડિએન્ટ્સમાં પાતળું કરવામાં આવે છે, અને CT મૂલ્ય અને નકલ નંબરના કોઓર્ડિનેટ્સમાં 5 બિંદુઓ દોરવામાં આવે છે, અને બિંદુઓ પ્રમાણભૂત વળાંક પેદા કરવા માટે એક રેખા બનાવવા માટે જોડાયેલા હોય છે.દરેક પ્રમાણભૂત વળાંક માટે, તેની માન્યતા તપાસવાની જરૂર છે.ઢોળાવનું મૂલ્ય –3.3 અને –3.8 ની વચ્ચે આવે છે, અને દરેક એકાગ્રતા ત્રિપુટીમાં કરવામાં આવે છે.પોઈન્ટ કે જે અન્ય પોઈન્ટથી નોંધપાત્ર રીતે અલગ હોય તેને કાઢી નાખવા જોઈએ.પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાનું CT મૂલ્ય પ્રમાણભૂત વળાંકમાં લાવવામાં આવે છે, અને પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાના અભિવ્યક્તિ સ્તરની ગણતરી કરી શકાય છે.

પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાનું સીટી મૂલ્ય પ્રમાણભૂત વળાંકમાં લાવવામાં આવે છે, અને પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાના પ્રારંભિક નકલ નંબરની ગણતરી કરી શકાય છે.

કાર્યક્ષમતા અને ઢાળ
પ્રમાણભૂત વળાંકનો ઢોળાવ રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆરની કાર્યક્ષમતા દર્શાવે છે.
· -3.322 ની ઢાળ સૂચવે છે કે PCR એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 1, અથવા 100% કાર્યક્ષમ છે, અને PCR ઉત્પાદનની માત્રા દરેક ચક્ર પર બમણી થાય છે.
-3.322 (દા.ત., -3.8) કરતાં ઓછી ઢાળ PCR કાર્યક્ષમતા દર્શાવે છે
· –3.322 (દા.ત., –3.0) કરતા વધારે ઢોળાવ સૂચવે છે કે PCR કાર્યક્ષમતા 100% કરતાં વધારે હોવાનું જણાય છે, જે વિચિત્ર છે, PCRનું એક ચક્ર એમ્પ્લીફાઇડ ઉત્પાદન કરતાં બમણા કરતાં વધુ કેવી રીતે પેદા કરી શકે?આ પરિસ્થિતિ પીસીઆર પ્રતિક્રિયાના બિન-રેખીય તબક્કામાં થાય છે, એટલે કે, બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનની મોટી માત્રા છે.

ગલન વળાંક
qPCR એમ્પ્લીફિકેશન પૂર્ણ થયા પછી, PCR ઉત્પાદનને ગરમ કરવામાં આવે છે.જેમ જેમ તાપમાન વધે છે તેમ, ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ એમ્પ્લીફિકેશન પ્રોડક્ટ ધીમે ધીમે ઓગળે છે, પરિણામે ફ્લોરોસેન્સની તીવ્રતામાં ઘટાડો થાય છે.જ્યારે ચોક્કસ તાપમાન (Tm) પહોંચી જાય છે, ત્યારે મોટી સંખ્યામાં ઉત્પાદનો ઓગળી જશે.ફ્લોરોસેન્સમાં તીવ્ર ઘટાડો થાય છે.વિવિધ પીસીઆર ઉત્પાદનોમાં વિવિધ ટીએમ મૂલ્યો અને અલગ ગલન તાપમાન હોય છે, જેથી પીસીઆરની વિશિષ્ટતા ઓળખી શકાય.

મેલ્ટિંગ કર્વ (વ્યુત્પન્ન વળાંક)
પીક મેપ બનાવવા માટે મેલ્ટિંગ કર્વ મેળવવામાં આવે છે, જે પીસીઆર પ્રોડક્ટના ટુકડાઓની પરિસ્થિતિને વધુ સાહજિક રીતે પ્રદર્શિત કરી શકે છે.ગલન તાપમાન એ DNA ટુકડાનું Tm મૂલ્ય હોવાથી, કેટલાક પરિમાણો કે જે DNA ટુકડાના Tm મૂલ્યને અસર કરે છે તે નક્કી કરી શકાય છે, જેમ કે ટુકડાનું કદ, GC સામગ્રી, વગેરે. સામાન્ય રીતે કહીએ તો, અમારા પ્રાઈમર ડિઝાઇન સિદ્ધાંતો અનુસાર,એમ્પ્લીફાઈડ પ્રોડક્ટની લંબાઈ 80-300bp ની રેન્જમાં છે, તેથી ગલન તાપમાન 80°C અને 90°C ની વચ્ચે હોવું જોઈએ.

ગલન વળાંકનું અર્થઘટન: જો એકમાત્ર મુખ્ય શિખર 80°C-90°C ની વચ્ચે દેખાય, તો તેનો અર્થ એ કે ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR સંપૂર્ણ છે;જો મુખ્ય શિખર 80°C-90°C ની વચ્ચે દેખાય છે અને પરચુરણ શિખરો 80°C ની નીચે દેખાય છે, તો પ્રાઇમર ડાઇમરને મૂળભૂત રીતે ગણવામાં આવે છે.તમે તેને ઉકેલવા માટે એનિલિંગ તાપમાન વધારવાનો પ્રયાસ કરી શકો છો;જો મુખ્ય શિખર 80°C-90°C ની વચ્ચે દેખાય છે અને જ્યારે તાપમાન વધે છે ત્યારે પરચુરણ શિખર ફરીથી દેખાય છે, તે મૂળભૂત રીતે માનવામાં આવે છે કે DNA દૂષણ છે, અને DNAને પ્રયોગના પ્રારંભિક તબક્કે દૂર કરવાની જરૂર છે.

અલબત્ત, હજુ પણ કેટલીક અસામાન્ય પરિસ્થિતિઓ છે, જે નીચે એક પછી એક તોડી નાખવામાં આવશે.
3. અદ્યતન જ્ઞાન

qPCR કરવા માટે, મારે MIQE કહેવું પડશે,ન્યૂનતમ માહિતીના પ્રકાશન માટેજથ્થાત્મકરીઅલ-ટાઇમ પીસીઆરપ્રયોગો - વાસ્તવિક સમયના જથ્થાત્મક PCR વિશે લેખો પ્રકાશિત કરવા માટેની ન્યૂનતમ માહિતીપ્રયોગોદરેકની સમજને સરળ બનાવવા માટે, અમે મુખ્ય સામગ્રીને સરળ બનાવીશું.

તમે ઇન્ટરનેટ પર MIQE ના મૂળ ટેક્સ્ટને શોધી શકો છો, અને સૌથી મહત્વની બાબત એ છે કે તેડેટા ચેકલિસ્ટ કે જે લેખ પ્રકાશિત કરતી વખતે પ્રદાન કરવાની જરૂર છે .

સમીક્ષકો આ વિગતો વાંચીને પ્રયોગની ગુણવત્તા નક્કી કરી શકે છે;ભાવિ વાચકો પણ પ્રયોગને પુનરાવર્તિત કરવા અથવા સુધારવા માટે આનો ઉપયોગ કરી શકે છે.
નોંધનીય છે કે આ સૂચિમાં, દરેક સૂચિનું મહત્વ અનુક્રમે E અથવા D સાથે ચિહ્નિત થયેલ છે.તેનો અર્થ શું છે?ઇ: આવશ્યક માહિતી (સબમિટ કરવી આવશ્યક છે);ડી: ઇચ્છનીય માહિતી (શક્ય તેટલી પ્રદાન કરો).

MIQE (1)-પ્રાયોગિક ડિઝાઇન
ઘણા બદમાશો કે જેમણે તેમના સ્નાતક અભ્યાસ પૂર્ણ કર્યા પછી તેમનો બચાવ પૂર્ણ કર્યો છે તેઓ જાણતા નથી કે સ્વતંત્ર રીતે પ્રયોગ કેવી રીતે ડિઝાઇન કરવો, તેમની નોટબુક કેવી રીતે ખોલવી અને શિક્ષક તેમને જે કરવાનું કહે તે કરવું.પરિણામે, પ્રાયોગિક ડિઝાઇન સખત ન હતી, અને સામયિકના સંપાદકીય વિભાગે કહ્યું કે તેઓ આ ચિત્ર અને તે ચિત્ર બનાવવા માંગે છે, તેથી તેઓએ સ્તબ્ધતામાં તે કર્યું.બદમાશો આ રીતે બને છે!

ઘરની નજીક, પ્રયોગનો પ્રથમ સિદ્ધાંત નક્કી કરવાનો છેપ્રાયોગિક તર્કની કઠોરતા.સૌથી મૂળભૂત બાબત પ્રાયોગિક ડિઝાઇન છે, અને પ્રાયોગિક ડિઝાઇન વિશેની સૌથી મહત્વની બાબત એ છે કે લક્ષ્ય નમૂના, સંદર્ભ નમૂના (નિયંત્રણ) અને પુનરાવર્તનોની સંખ્યા કેવી રીતે સેટ કરવી, જેથી પ્રાયોગિક ડેટા સંદર્ભિત, તુલનાત્મક અને ખાતરી કરી શકાય.

લક્ષ્ય નમૂનાતે નમૂનાનો સંદર્ભ આપે છે કે જે ચોક્કસ સારવાર પછી લક્ષ્ય જનીનને શોધવા માટે જરૂરી છે.સંદર્ભ નમૂનાકોઈપણ સારવાર વિનાનો નમૂનો છે, જેને જીવવિજ્ઞાનમાં વારંવાર જંગલી પ્રકાર તરીકે ઓળખવામાં આવે છે.

પ્રાયોગિક પ્રતિકૃતિઓખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.સામાન્ય રીતે, પ્રેરક પ્રતિકૃતિઓની સંખ્યા ત્રણ કરતાં વધુ હોવી જોઈએ.જૈવિક પ્રતિકૃતિ શું છે અને તકનીકી પ્રતિકૃતિ શું છે તે તફાવત કરવો જરૂરી છે.

જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ: વિવિધ સામગ્રી (સમય, છોડ, બેચ, પ્રતિક્રિયા પ્લેટો) સાથે કરવામાં આવેલ સમાન ચકાસણી પ્રયોગ.

જૈવિક ડુપ્લિકેશન
ચાલો ઉદાહરણ તરીકે મરીની જંતુનાશક સારવાર લઈએ.અમે ABC ના ત્રણ છોડ પર જંતુનાશકોનો છંટકાવ કરવા માંગીએ છીએ, પછી ABC ના ત્રણ છોડ ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ છે, અને તે એક જ ચકાસણી પ્રયોગ છે જે વિવિધ સામગ્રીઓ સાથે હાથ ધરવામાં આવે છે.પરંતુ એક પ્રયોગ તરીકે, એક નિયંત્રણ ચોક્કસપણે જરૂરી છે, તેથી અમે છોડ A નું પ્રાયોગિક જૂથ બનાવવા માટે છોડ A ની શાખાઓમાંથી એકનો છંટકાવ કરી શકીએ છીએ, અને નિયંત્રણ જૂથ બનાવવા માટે છોડ A ની અન્ય શાખાઓને છાંટતા નથી.B અને C માટે પણ આવું કરો.

ટેકનિકલ પ્રતિકૃતિઓ (તકનીકી પ્રતિકૃતિઓ): તે એક પુનરાવર્તિત પ્રયોગ છે જે ઓપરેશનને કારણે થતી ભૂલોને ટાળવા માટે રચાયેલ છે, જે વાસ્તવમાં સમાન સામગ્રીમાં સમાવિષ્ટ ડુપ્લિકેટ છિદ્ર છે.બંને સારવાર અને નિયંત્રણો લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીનની નકલ સેટિંગ્સ (ઓછામાં ઓછા ત્રણ) હોવા જોઈએ.

તકનીકી પુનરાવર્તન
જંતુનાશકો સાથે સારવાર કરાયેલ મરીને ફરીથી ઉદાહરણ તરીકે લો.પ્લાન્ટ A ના પ્રાયોગિક જૂથ માટે, અમે તેના લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીન માટે અનુક્રમે 1, 2, અને 3 ના ત્રણ PCR છિદ્રો બનાવ્યા, જેથી શોધ પછી સરેરાશ લઈ શકાય.છોડના નિયંત્રણ માટે A જૂથોને પણ એ જ રીતે ગણવામાં આવે છે.એ જ રીતે, બી અને સી છોડ માટે સમાન સારવાર કરો.આ તકનીકી પુનરાવર્તન છે.

નોંધનીય છે કેઆંકડામાં જે દાખલ થાય છે તે જૈવિક પુનરાવર્તન છે, અને તકનીકી પુનરાવર્તન પ્રાયોગિક પ્રક્રિયામાં કોઈ અવ્યવસ્થિત ઘટના છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે છે, જેથી પ્રાયોગિક પરિણામોને વિશ્વસનીય બનાવી શકાય, એટલે કે, આપણે વારંવાર કહીએ છીએ તેમ તેમની સરેરાશ લઈને ભૂલોને ટાળવા.

નકારાત્મક નિયંત્રણો-NTC અને NRT
NTC (નો-ટેમ્પલેટ કંટ્રોલ), ટેમ્પલેટ વિનાનું નિયંત્રણ, પ્રાયોગિક સામગ્રી દૂષિત છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે વપરાય છે.સામાન્ય રીતે, પાણીનો ઉપયોગ નમૂના તરીકે થાય છે.જો ત્યાં ફ્લોરોસન્ટ પ્રતિક્રિયા હોય, તો તે સૂચવે છે કે પ્રયોગશાળામાં ન્યુક્લીક એસિડનું દૂષણ થયું છે.

આ પ્રદૂષણો આમાંથી આવે છે: અશુદ્ધ પાણી, અંતર્જાત ડીએનએ ધરાવતા અયોગ્ય રીએજન્ટ્સ, પ્રાઈમર પ્રદૂષણ, લેબોરેટરી સાધનોનું પ્રદૂષણ, એરોસોલ પ્રદૂષણ વગેરે, RNase સ્કેવેન્જર્સ અને RNase અવરોધકોનો ઉપયોગ કરવાની જરૂર છે.એરોસોલ પ્રદૂષણ શોધવાનું સૌથી મુશ્કેલ છે.કલ્પના કરો કે તમારી પ્રયોગશાળા ધુમ્મસ જેવી છે, જેમાં વિવિધ ન્યુક્લિક એસિડ હવામાં લટકેલા છે.

NRT (નો-રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેજ), રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન વિનાનું નિયંત્રણ, નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે બિન-રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન RNA છે, જે gDNA અવશેષોનું નિયંત્રણ છે.

જનીન અભિવ્યક્તિ કરતી વખતે, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન પછી સીડીએનએની માત્રા શોધીને આરએનએની માત્રા શોધી કાઢવામાં આવે છે.જો આરએનએ શુદ્ધ કરવામાં આવે ત્યારે જીડીએનએ અવશેષો હોય, તો તે પ્રાયોગિક પરિણામોમાં ભૂલો પેદા કરશે, કારણ કે પ્રાપ્ત થયેલા વાસ્તવિક પરિણામો જીડીએનએ અને સીડીએનએ છે.એકંદર સ્તરે, માત્ર સીડીએનએ જ નહીં, આરએનએ નિષ્કર્ષણ દરમિયાન જીડીએનએને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવાની જરૂર છે.

MIQE (2)-નમૂનાની માહિતી
કહેવાતી નમૂના માહિતીનો અર્થ એ છે કે જ્યારે આપણે qPCR વિશે કોઈ લેખ પ્રકાશિત કરીએ છીએ, ત્યારે આપણે નમૂનાની માહિતીને સ્પષ્ટપણે સમજાવવી જોઈએ, જે લેખનો અનિવાર્ય ભાગ છે.એ જ રીતે, જ્યારે આપણે નમૂનાઓની પ્રક્રિયા કરીએ છીએ, ત્યારે આપણે નમૂનાઓની માન્યતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે અમારી પોતાની કામગીરીનું પણ નિયમન કરવું જોઈએ.

નમૂનાનું વર્ણન માત્ર એક પરિણામ છે, અને આપણે સમગ્ર પ્રયોગ દરમિયાન લેવામાં આવેલી સામગ્રી પર વધુ ધ્યાન આપવું જોઈએ.

પ્રાયોગિક સામગ્રીની પસંદગી
લોહીના નમૂનાઓ - તાજા લોહી પસંદ કરો, 4 કલાકથી વધુ નહીં.કોષના નમૂનાઓ - જોરશોરથી વૃદ્ધિના સમયગાળામાં તાજા કોષો એકત્રિત કરવાનું પસંદ કરો.એનિમલ ટીશ્યુ - તાજા, જોરશોરથી વધતી પેશી પસંદ કરો.છોડની પેશી - તાજી, યુવાન પેશી પસંદ કરો.

તમે નોંધ્યું હશે કે આ થોડા વાક્યોમાં એક મુખ્ય શબ્દ છે: fresh.
ઉપરોક્ત નમૂનાઓ માટે, બજારમાં શ્રેષ્ઠ, ખર્ચ-અસરકારક અને સ્થિર કીટ ફોરજીનની કીટ છે, જે તેમના ડીએનએ અને આરએનએને ઝડપથી અને સરળતાથી કાઢી શકે છે.

બ્લડ ડીએનએ મીની કીટ

સેલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ

એનિમલ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કિટ

પ્લાન્ટ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ

પ્લાન્ટ ટોટલ આરએનએ આઇસોલેશન કીટ પ્લસ

પ્લાન્ટ ડીએનએ આઇસોલેશન કીટ

પ્રાયોગિક સામગ્રીનો સંગ્રહ
સામાન્ય રીતે કહીએ તો, જો શરતો પરવાનગી આપે તો અમે નમૂનાઓ સંગ્રહિત કરવાની ભલામણ કરતા નથી.જો કે, એવા ઘણા મિત્રો છે જેઓ નમૂના લીધા પછી તરત જ પ્રયોગો કરી શકતા નથી, અને કેટલાકને તો નમૂના લેવા માટે પ્રવાહી નાઇટ્રોજનની ટાંકી ખેતરમાં લઈ જવાની જરૂર પડે છે.

આ પ્રકારના મહેનતુ મિત્ર માટે, હું એટલું જ કહી શકું છું કે તમે રીએજન્ટ ઉપભોજ્ય વસ્તુઓને સમજી શકતા નથી.હવે ઘણી રીએજન્ટ ઉપભોજ્ય કંપનીઓ રીએજન્ટ ઉત્પન્ન કરે છે જે ઓરડાના તાપમાને RNA નમૂનાઓ સંગ્રહિત કરી શકે છે, અને તમે તેનો ઉપયોગ કરવાનું પસંદ કરી શકો છો.પરંપરાગત સંગ્રહ પદ્ધતિ એ પ્રવાહી નાઇટ્રોજન સંગ્રહ છે, જેમાં વહન કરવામાં સરળ હોય તેવી નાની પ્રવાહી નાઇટ્રોજન ટાંકીનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.નમૂનાને પ્રયોગશાળામાં પાછા લાવ્યા પછી, તેને -80 ° સે રેફ્રિજરેટરમાં સંગ્રહિત કરો.

આરએનએ સંડોવતા પ્રયોગો માટે, છ-શબ્દના સિદ્ધાંતનું પાલન કરવું આવશ્યક છે:નીચા તાપમાન, કોઈ ઉત્સેચકો નથી,અનેઝડપી .

નીચા તાપમાનનો ખ્યાલ સમજવો સરળ છે;ઉત્સેચકો વિના, આપણે જે વિશ્વમાં રહીએ છીએ ત્યાં RNase દરેક જગ્યાએ છે (અન્યથા તમે HIV દ્વારા માર્યા ગયા હોત), તેથી પ્રયોગો કરતી વખતે RNase કેવી રીતે ટાળવું તે ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ ખ્યાલ છે;ઝડપીદુનિયામાં એવું કોઈ કુંગ ફુ નથી જેને તોડી ન શકાય, માત્ર સ્પીડને તોડી ન શકાય.

તેથી, એક અર્થમાં, નિષ્કર્ષણનો સમય જેટલો ઓછો છે, તેટલી સારી કીટ.શા માટે કરે છેફોરજીનની કીટ ઝડપ પર ભાર મૂકે છે, કારણ કે તેઓ તેને સારી રીતે જાણે છે.

તા.તેઓને લાગે છે કે ઈશ્વર અન્યાયી છે, બીજાઓ વિશે ફરિયાદ કરે છે અને જીવન શોધે છે.હકીકતમાં, તેણીને તે સમજાયું નહીં.તેણે આરએનએનું સારી રીતે રક્ષણ કર્યું ન હતું, અને સ્લેમ ડંક પ્લેયર ફોરું અને હરવાફરવામાં ચપળ કે ચાલાક હતો.જ્યારે તે પ્રયોગ કરી રહ્યો હતો, ત્યારે તેણે વિચાર્યું કે તે ત્રણ વખત, પાંચ વખત અને બે વિભાગો સાથે સ્લેમ ડંક સમાપ્ત કરશે, પરંતુ તેણે પ્રયોગ સારી રીતે કર્યો.

નૉૅધ: ધીમી, RNase આક્રમણની વધુ તકો.તમારી જાતને ઝડપી બનવા માટે કેવી રીતે તાલીમ આપવી?ત્યાં કોઈ રસ્તો નથી, ફક્ત વધુ પ્રેક્ટિસ કરો.

વિવિધ પ્રયોગો અને વિવિધ નમૂનાઓ માટે, હજુ પણ વધુ સાહિત્ય વાંચવું અને પ્રક્રિયા માટે યોગ્ય પદ્ધતિ પસંદ કરવી જરૂરી છે.નમૂનાના સંગ્રહ અને સંગ્રહ પ્રક્રિયા માટે, MIQE એ જરૂરી છે કે તે કાગળમાં સ્પષ્ટ રીતે લખાયેલું હોવું જોઈએ, જેથી સમીક્ષકો કાગળની વિશ્વસનીયતાની સમીક્ષા કરી શકે, અને સ્તબ્ધ યુવાનો માટે તમારા પ્રયોગનું પુનરાવર્તન કરવું પણ અનુકૂળ છે.

જૈવિક પ્રયોગો મુશ્કેલ હોવા છતાં, તે ઉચ્ચ સ્તરના છે.જો તમે સાવચેત ન રહો, તો તમે વિશ્વને ઉથલાવી શકો છો.ઉદાહરણ તરીકે, SARS ને બાયોકેમિકલ કટોકટીમાં બનાવવું, અથવા 1.3 અબજ લોકોને બચાવવા માટે હાઇબ્રિડ ચોખા બનાવવા.નીચેનું ચિત્ર એક રાસાયણિક પ્રયોગ છે, તમારે તેના ડિક જેવા દેખાવને જોઈને સમજવું જોઈએ કે તમે તમારા સંશોધન પર કેટલો ગર્વ અનુભવો છો.તેને ભૂલી જાઓ, તેને કાળો કરશો નહીં.

MIQE (3) - ન્યુક્લિક એસિડ નિષ્કર્ષણ.
ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ એ એક મોટી ઘટના છે, અને તમામ પરમાણુ જીવવિજ્ઞાન પ્રયોગો ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણથી શરૂ થાય છે.સૌ પ્રથમ, ચાલો ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ પર MIQE ની સામગ્રીની નકલ કરીએ.

આ સ્વરૂપને જોતા, તમે સપાટી પર રહી શકતા નથી.સ્વરૂપ એક અંધવિશ્વાસ છે.ટોચના વિદ્યાર્થી બનવા માટે, તમારે શા માટે પૂછવું આવશ્યક છે.આ કોષ્ટકની આવશ્યક સામગ્રી છે: પીછોઆરએનએની શુદ્ધતા, અખંડિતતા, સુસંગતતા અને નિષ્કર્ષણ જથ્થો .

ના પ્રથમ ભાગપ્રક્રિયા અથવા સાધન એ ન્યુક્લીક એસિડ નિષ્કર્ષણ પગલું છે.જો તમે એક્સટ્રેક્ટ કરવા માટે ઓટોમેટિક ન્યુક્લીક એસિડ એક્સટ્રેક્ટરનો ઉપયોગ કરો છો (અદ્યતન, કૃપા કરીને ખરીદી માટે મારો સંપર્ક કરો), તમારે સાધનનું મોડલ નામ સૂચવવાની જરૂર છે.

કીટનું નામ અને

ફેરફારની વિગતો માટે કઈ કીટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, કયા વિશિષ્ટ રીએજન્ટ્સ ઉમેરવામાં આવ્યા હતા અથવા કઈ વિશેષ કામગીરી કરવામાં આવી હતી તે સ્પષ્ટપણે સમજાવવું જોઈએ જેથી કરીને અન્ય લોકો સરળતાથી તમારા પ્રયોગનું પુનરાવર્તન કરી શકે.

કેટલાક લોકો ખાસ નમૂનાઓ કાઢતી વખતે કેટલાક વિશિષ્ટ રીએજન્ટ ઉમેરે છે, એમ વિચારીને કે આ તેમનું ગુપ્ત શસ્ત્ર છે અને અન્યને જણાવતા નથી.તેને ગુપ્ત રાખતી વખતે, તેઓ તમારા લેખને ચમકાવવાની તક પણ ગુમાવે છે.હોંશિયાર ન બનો, તમારે વૈજ્ઞાનિક સંશોધનમાં દેશના જૂના ઝાંગ કરતાં વધુ પ્રમાણિક બનવું પડશે, જો તમારે હોંશિયાર બનવું હોય તો લેખ તમને મૂર્ખ બનાવી દેશે.

કીટનો ઉત્પાદન નંબર યાદ રાખવો જોઈએજ્યારે તમે કીટ ઓર્ડર કરો અને લેખ લખો.કીટ પર સામાન્ય રીતે બે નંબરો હોય છે: કેટ-કેટલોગ નંબર (ઉત્પાદન નંબર, લેખ નંબર), લોટ-પ્રોડક્ટ લોટ નંબર ( ઉત્પાદન કઈ બેચમાંથી આવ્યું છે તે દર્શાવવા માટે વપરાય છે).

વધુમાં, બાયોકેમિકલ રીએજન્ટ્સ ઓર્ડર કરતી વખતે CAS નંબરનો વારંવાર ઉપયોગ થાય છે, અને હું તેને એકસાથે લોકપ્રિય બનાવીશ.CAS નંબર એ અમેરિકન કેમિકલ સોસાયટી દ્વારા દરેક નવી રાસાયણિક દવાને આપવામાં આવેલ નંબર છે.સામાન્ય રીતે, ત્રણ નંબરો ડેશ દ્વારા જોડાયેલા હોય છે.રૂશુઇનો CAS નંબર: 7732-18-5.રસાયણોમાં ઘણીવાર બહુવિધ ઉપનામો હોય છે, પરંતુ CAS નંબર અનન્ય હોય છે.દવાનો ઓર્ડર આપતી વખતે, તમે પહેલા તેનો CAS નંબર ચેક કરી શકો છો.

ઘરની નજીક, આપણે આ વસ્તુઓનું સ્પષ્ટ વર્ણન શા માટે કરવું જોઈએ?હકીકતમાં, તે આરએનએ નિષ્કર્ષણની ગુણવત્તા તપાસવાનું પણ છે.સાધનો અને કીટનો ઉપયોગ RNA નિષ્કર્ષણને વધુ સુસંગત બનાવશે.સામાન્ય પ્રયોગશાળાઓનો નિષ્કર્ષણ સ્કેલ મોટો નથી, અને તે કિટ્સ દ્વારા મેળવી શકાય છે.

DNase અથવા RNase સારવારની વિગતો
ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆરનો મહત્વનો મુદ્દો ડીએનએ દૂષણને રોકવાનો છે, અને જો દૂષણ હોય તો પ્રયોગ કરશો નહીં.તેથી, પ્રાયોગિક પ્રક્રિયામાં ડીએનએ સંપૂર્ણપણે અને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવામાં આવ્યું છે તે દર્શાવવા માટે, તમે ડીએનએ પર પ્રક્રિયા કરવા માટે જે પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કર્યો હતો તે જણાવવું હિતાવહ છે.યોજનાકીય રેખાકૃતિ દ્વારા રજૂ થાય છે.

આરએનએ અને ડીએનએનું યોજનાકીય આકૃતિ
સામાન્ય રીતે, ડીએનએને દૂર કરવાની પદ્ધતિ એ છે કે નિષ્કર્ષણ પછી ડીએનએઝ સાથે આરએનએની સારવાર કરવી.જો કે, આ પ્રમાણમાં જૂની પદ્ધતિઓ છે.વાણિજ્યિક RNA નિષ્કર્ષણ કિટ્સ DNase ઉમેર્યા વિના નિષ્કર્ષણ પ્રક્રિયા દરમિયાન DNA દૂર કરવામાં સક્ષમ છે.ઉદાહરણ તરીકે, ફોરજીનમાંથી કીટની શ્રેણી.

નૉૅધ: આરએનએ નિષ્કર્ષણ દરમિયાન ડીએનએ દૂર કરવું એ ખૂબ જ ખતરનાક બેધારી તલવાર છે, જે આરએનએ નિષ્કર્ષણની કામગીરીના સમયને લંબાવશે અને આરએનએ ડિગ્રેડેશનનું જોખમ વધારશે.મૂળભૂત રીતે, તે આરએનએ ઉપજ અને શુદ્ધતા વચ્ચેનો વેપાર છે.

વધુમાં, સિલિકા-આધારિત શોષણ કૉલમમાં ઉમેરવામાં આવેલ DNase ની માત્રા ખૂબ જ ઓછી છે, અને અસર હાંસલ કરવા માટે ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા DNase નો ઉપયોગ કરવો આવશ્યક છે.અપ્રમાણિત DNase ઝડપથી અને સંપૂર્ણ રીતે પચાવી શકાતું નથી.આ વેપારીના ટેકનિકલ સ્તરની કસોટી છે.અલબત્ત, ત્યાં પણ વધુ વિચિત્ર વેપારીઓ છે જેઓ શેખી કરે છે કે ડીએનએ ડીએનએઝ વિના દૂર કરી શકાય છે.એવું કહી શકાય કે ડીએનએ ડીએનએ વિના સંપૂર્ણપણે દૂર કરી શકાય છે તેવી બડાઈ મારનાર કોઈપણ ગુંડો છે.ડીએનએ પ્રમાણમાં સ્થિર ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ માળખું છે, અને તે માત્ર વાત કરીને અને હસવાથી ભૂંસી શકાતું નથી.

દૂષણ આકારણી
મૂલ્યાંકન પદ્ધતિ: ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ શોધ, 1% એગરોઝ, 6V/સેમી, 15 મિનિટ, લોડિંગ 1-3 ul

ન્યુક્લિક એસિડ જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ
સામાન્ય રીતે યુવી સ્પેક્ટ્રોફોટોમીટરનો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવે છે.ચાલો હું પહેલા OD260, OD280 અને OD230 ના ત્રણ મૂલ્યોનો અર્થ લોકપ્રિય કરું.
·OD260nm: તે ન્યુક્લીક એસિડના સૌથી વધુ શોષણની ટોચની શોષણ તરંગલંબાઇ છે, અને શ્રેષ્ઠ માપેલ મૂલ્ય 0.1 થી 1.0 સુધીની છે.જો નહિં, તો તેને રેન્જમાં લાવવા માટે નમૂનાને પાતળો અથવા કેન્દ્રિત કરો.
·OD280nm: તે પ્રોટીન અને ફિનોલિક પદાર્થોના સૌથી વધુ શોષણની ટોચની શોષણ તરંગલંબાઇ છે.
·OD230nm: તે કાર્બોહાઇડ્રેટ્સના સૌથી વધુ શોષણની ટોચની શોષણ તરંગલંબાઇ છે.

આગળ, ચાલો દરેક સૂચકની ભૂમિકા વિશે વાત કરીએ.A260 માટે, તેનો ઉપયોગ ન્યુક્લીક એસિડની ઉપજને માપવા માટે થઈ શકે છે.જ્યારે OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

શુદ્ધતા માટે, આપણે સામાન્ય રીતે જે ગુણોત્તર જોઈએ છીએ તે જોવાની જરૂર છે: OD260/280 અને OD260/230.
શુદ્ધ DNA: OD260/280 લગભગ 1.8 બરાબર છે.જ્યારે તે 1.9 કરતા વધારે હોય છે, ત્યારે તે સૂચવે છે કે RNA પ્રદૂષણ છે, અને જ્યારે તે 1.6 કરતા ઓછું હોય છે, તે સૂચવે છે કે પ્રોટીન અને ફિનોલ પ્રદૂષણ છે.
શુદ્ધ આરએનએ: 1.7
·OD260/230: ભલે તે DNA હોય કે RNA, સંદર્ભ મૂલ્ય 2.5 છે.જ્યારે તે 2.0 કરતા ઓછું હોય છે, ત્યારે તે સૂચવે છે કે ખાંડ, મીઠું અને કાર્બનિક પદાર્થોનું પ્રદૂષણ છે.

આરએનએ અખંડિતતા

આરએનએની અખંડિતતા માપવી ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.સામાન્ય રીતે, 28S અને 18S RNA વચ્ચેની બ્રાઇટનેસ બે ગણો સંબંધ છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે RNA ડિનેચરેશન જેલ પ્રયોગ કરવો જરૂરી છે.જ્યારે ત્રીજો બેન્ડ 5S દેખાય છે, ત્યારે તેનો અર્થ એ થાય છે કે અપૃષ્ઠવંશી પ્રાણીઓ સિવાય, આરએનએ અધોગતિ કરવાનું શરૂ કર્યું છે.

RNA ગુણવત્તા મૂલ્યાંકન માટેનો ડેટા: ઉપરોક્ત પરીક્ષણો ઉપરાંત, RNA અખંડિતતાના સંદર્ભમાં કેટલાક વધુ અદ્યતન સાધન પરીક્ષણો પણ છે, જેમ કે એક્સપિરિયન ઓટોમેટિક ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ સિસ્ટમનું RQI અખંડિતતા પરીક્ષણ, જે શોધી શકે છે કે RNA અદ્રશ્ય રીતે અધોગતિ પામ્યું છે કે કેમ.

વૈજ્ઞાનિક સંશોધનમાં, ફ્લોરોસન્ટ માત્રાત્મક PCR એ લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીન વચ્ચેની સરખામણી છે.તેથી, આરએનએ નમૂનાની જાળવણી, આરએનએ નિષ્કર્ષણ, વગેરેની પ્રક્રિયામાં, પ્રાથમિક ધ્યેય આરએનએની અખંડિતતાને સુનિશ્ચિત કરવાનો છે.

RNA ની અખંડિતતા લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીન વચ્ચેના સંતુલનને કેવી રીતે અસર કરે છે તે નીચેની આકૃતિ પરથી સરળતાથી સમજી શકાય છે.અધોગતિ જનીનની અપૂર્ણતા તરફ દોરી જશે, પછી ભલે તે આંતરિક સંદર્ભ જનીનની અપૂર્ણતા હોય અથવા લક્ષ્ય જનીનની અપૂર્ણતા હોય, તે ડેટા પર મોટી અસર કરશે.

લક્ષ્ય જનીન અને સંદર્ભ જનીનનું યોજનાકીય આકૃતિ, સાચું ન હોવું જોઈએ

નિષેધ કસોટી (પછી ભલે સીટી મૂલ્ય વધારે કે ઓછી સાંદ્રતા અથવા અન્ય પરિસ્થિતિઓમાં દબાયેલું હોય)

આ આંકડોને ઉદાહરણ તરીકે લેતા, પાંચ વણાંકોના Ct મૂલ્યો નીચે મુજબ છે.વળાંકો વચ્ચે CT મૂલ્યોનું વિતરણ અસમાન છે, અને Ct મૂલ્યો ઉચ્ચ અને નીચી સાંદ્રતા હેઠળ વિલંબિત છે, જે PCR અવરોધનો કેસ છે.

મુખ્ય મુદ્દો: આરએનએ નિષ્કર્ષણની પ્રક્રિયામાં, આપણે ખોટી માન્યતાઓને છોડી દેવાની અને સાચી માન્યતાઓ સ્થાપિત કરવાની જરૂર છે.

ખોટો વિચાર છે: આરએનએ નિષ્કર્ષણ માત્ર ઉપજને અનુસરે છે, એમ વિચારીને કે આરએનએની માત્રા જેટલી વધારે છે તેટલું સારું.વાસ્તવમાં, જ્યારે આપણે ક્વોન્ટિફિકેશન કરીએ છીએ, જો જનીનોની સંખ્યા બહુ મોટી ન હોય, તો આપણને વધારે આરએનએની જરૂર નથી.તમે જે આરએનએ કાઢો છો તે પર્યાપ્ત કરતાં વધુ છે.

સાચો ખ્યાલ છે:આરએનએ નિષ્કર્ષણમાં શુદ્ધતા, અખંડિતતા અને સુસંગતતા હોવી જોઈએ.શુદ્ધતા એ સુનિશ્ચિત કરી શકે છે કે અનુગામી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અવરોધિત નથી અને ડેટા ડીએનએ દ્વારા પ્રભાવિત થશે નહીં.અખંડિતતા લક્ષ્ય સિક્વન્સ અને આંતરિક સંદર્ભોનું સંતુલન સુનિશ્ચિત કરે છે.સુસંગતતા સ્થિર નમૂના લોડિંગની ખાતરી કરે છે.

MIQE (4) - રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન
ગેરસમજ: ઉચ્ચ સેમ્પલ વોલ્યુમની શોધ.
સાચો ખ્યાલ: સુસંગતતા (સ્થિરતા)નો પીછો કરો, આરએનએ લોડ કરેલા જથ્થાને ધ્યાનમાં લીધા વિના, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનની કાર્યક્ષમતા સુસંગત રહે છે, તેની ખાતરી કરીને કે cDNA માં તફાવતો ખરેખર mRNA માં તફાવતોને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે.
અમે આ પ્રક્રિયાને યોજનાકીય રેખાકૃતિ સાથે સમજાવીએ છીએ:

રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતાનું યોજનાકીય આકૃતિ, સાચું ન બનો
સૌ પ્રથમ, આપણે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રક્રિયા અને પીસીઆર પ્રક્રિયા વચ્ચેના તફાવતને સમજવાની જરૂર છે.પીસીઆર બહુવિધ હીટિંગ અને એનેલીંગ પ્રક્રિયાઓમાંથી પસાર થાય છે, અને લક્ષ્ય ટુકડો ઝડપથી વધે છે;જ્યારે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનમાં આ પ્રક્રિયા હોતી નથી, ત્યારે આપણે કલ્પના કરી શકીએ છીએ કે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન વાસ્તવમાં એક-થી-એક છે પ્રતિકૃતિ પ્રક્રિયા દરમિયાન, આરએનએના ઘણા ટુકડાઓ

કારણ કે ત્યાં cDNA માહિતીના ઘણા ટુકડાઓ મળી શકે છે, તે અત્યાર સુધીમાં સમજી લેવું જોઈએ, કારણ કે મોટા અને નાના ટુકડાઓ વિપરીત-લિખિત કરવામાં આવ્યા છે, અને એક ટુકડા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરવું અશક્ય છે.અને આરએનએનું પ્રમાણ પ્રમાણમાં નાનું હોવાને કારણે, મેળવેલ સીડીએનએનું પ્રમાણ પણ પ્રમાણમાં નાનું છે, પીસીઆરથી વિપરીત, જે એમ્પ્લીફિકેશન અસર ધરાવે છે, તેથી તે શોધવું મૂળભૂત રીતે અશક્ય છે.

સીડીએનએ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ પરિણામો
બીજું, આદર્શ રીતે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન એક-થી-એક કરવામાં આવે છે, પરંતુ કોઈપણ કંપની તરફથી કોઈ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન આ અસર પ્રાપ્ત કરી શકતું નથી.મૂળભૂત રીતે, મોટાભાગના રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસની કાર્યક્ષમતા 30-50% ની વચ્ચે ભટકતી હોય છે.જો આ કિસ્સો હોય, તો અમારી પાસે પ્રમાણમાં સ્થિર રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા હશે, જે આપણે આકૃતિમાં જોવા માંગીએ છીએ: 3 RNA ને 2 cDNAs મળે છે, 6 RNA ને 4 cDNA મળે છે, તેથી ગમે તેટલો નમૂનો લોડ કરવામાં આવે તો પણ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા પ્રમાણમાં સ્થિર છે.અમે એવી પરિસ્થિતિ જોવા નથી માંગતા કે જ્યાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા અસ્થિર હોય અને ઉચ્ચ સાંદ્રતા અવરોધાય.

તો, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા સ્થિર છે કે કેમ તે કેવી રીતે ચકાસવું?પદ્ધતિ ખૂબ જ સરળ છે, તમારે માત્ર એક તુલનાત્મક પરીક્ષણ કરવાની જરૂર છે: એક RNA ના બમણા મંદન પછી cDNA માં રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવું, અને બીજું cDNA માં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિબિંગ પછી બમણું મંદન કરવું, અને પછી મેળવેલ ઢોળાવને જોવા માટે qPCR કરો તે સુસંગત છે.ટોચના વિદ્યાર્થી તરીકે, તમારે તેને સેકન્ડોમાં સમજી લેવું જોઈએ.નીચે બતાવ્યા પ્રમાણે:

રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનની કાર્યક્ષમતા સ્થિર છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે આરએનએ અને સીડીએનએનું મંદન
રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને કીટ
કેવી રીતે સંપૂર્ણ ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆરમાં ઉત્તમ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને કીટ હોઈ શકે છે.રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝને સ્ત્રોત અનુસાર લગભગ બે પ્રકારમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે, AMV અથવાએમ-એમએલવી, અને તેમનું પ્રદર્શન કોષ્ટકમાં બતાવેલ સમાન છે.

RNase H પ્રવૃત્તિ
RNase H એ રિબોન્યુક્લીઝ એચ છે, ચાઇનીઝ નામ રિબોન્યુક્લીઝ એચ છે, જે એન્ડોરીબોન્યુક્લીઝ છે જે ખાસ કરીને DNA-RNA હાઇબ્રિડ સાંકળમાં RNA ને હાઇડ્રોલાઈઝ કરી શકે છે.RNase H ફોસ્ફોડિસ્ટર બોન્ડને સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ અથવા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA અથવા RNAમાં હાઇડ્રોલાઈઝ કરી શકતું નથી, એટલે કે, તે સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ અથવા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA અથવા RNAને ડાયજેસ્ટ કરી શકતું નથી.સામાન્ય રીતે cDNA ના બીજા સ્ટ્રાન્ડના સંશ્લેષણમાં વપરાય છે.

તે એક વિચિત્ર બાબત છે.અમે કહીએ છીએ કે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝમાં RNase H પ્રવૃત્તિ હોય છે, એવું નથી કે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝમાં RNase H હોય છે, અને RNase Hને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝથી અલગ કરવું શક્ય ન પણ હોય, કદાચ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝમાં અમુક જૂથોની રચનાને કારણે આ પ્રવૃત્તિ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસને કારણે થાય છે.

તેથી, AMV ની ઉચ્ચ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતાને ધ્યાનમાં લીધા વિના, તેની RNase H પ્રવૃત્તિ cDNA ની ઉપજ ઘટાડે છે.અલબત્ત, રીએજન્ટ ઉત્પાદકો સીડીએનએની ઉપજ વધારવા માટે શક્ય તેટલું રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેઝમાં RNase H પ્રવૃત્તિને દૂર કરવા માટે તેમના ઉત્પાદનોને સતત ઑપ્ટિમાઇઝ કરી રહ્યાં છે.
એનિલિંગ તાપમાન

વિવિધ તાપમાને આરએનએનું ગૌણ માળખું
જુદા જુદા તાપમાને RNA ની ગૌણ રચના માટે ઉપરની આકૃતિ જુઓ, અને ચોક્કસ તાપમાન અને મીઠાની સાંદ્રતાની સ્થિતિમાં લક્ષ્ય ટુકડાની ગૌણ રચના નક્કી કરવા માટે mFold ઓનલાઈન ટૂલનો ઉપયોગ કરો.55°C પર, RNA નું ગૌણ માળખું હજુ પણ ખૂબ જ જટિલ છે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ કામ કરી શકતું નથી, અને ગૌણ માળખું 65°C સુધી સંપૂર્ણપણે ઉકેલી શકાતું નથી, જ્યારે AMV અને M-MLVનું શ્રેષ્ઠ તાપમાન આ તાપમાન કરતાં ઘણું ઓછું છે.
શુ કરવુ?ગૌણ માળખું એ ટેમ્પલેટની જ પૂરક જોડી છે, જે પ્રાઈમર અને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ અને ટેમ્પલેટ વચ્ચે મજબૂત સ્પર્ધા તરફ દોરી જાય છે, જેના પરિણામે ઓછી E અને નબળી પુનરાવર્તિતતા જેવી સમસ્યાઓની શ્રેણીમાં પરિણમે છે.

શુ કરવુ?માત્ર શક્ય તેટલું જ એનિલિંગ તાપમાન વધારવું.

ઘણા રીએજન્ટ ઉત્પાદકો આનુવંશિક ઇજનેરી દ્વારા તેમના રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટને સુધારી રહ્યા છે.કેટલાક પ્રતિક્રિયા તાપમાનમાં વધારો કરે છે, જેમ કે જીફાન અને આઈડેલાઈ, અને કેટલાક એન્ઝાઇમ અને આરએનએ ટેમ્પ્લેટ વચ્ચેના સંબંધને સુધારવા માટે RNase H એન્ઝાઇમના સક્રિય જૂથને દૂર કરે છે.ઉચ્ચ આકર્ષણ સ્પર્ધાત્મક રીતે ગૌણ માળખું બહાર કાઢી શકે છે અને સરળતાથી વાંચી શકે છે, અને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનની કાર્યક્ષમતામાં પણ ઘણો સુધારો કરી શકે છે.
મુખ્ય મુદ્દો: રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતાની સુસંગતતાને અનુસરવા માટે રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન વધુ મહત્વનું છે (એન્ઝાઇમ માત્ર કાર્યક્ષમ જ નહીં પણ સ્થિર પણ હોવા જોઈએ), લોડ કરેલા નમૂનાના જથ્થાને બદલે, જો તે ખાસ કરીને મોટા પાયે ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR ન હોય, તો તે બિલકુલ શક્ય બનશે નહીં.બહુવિધ સીડીએનએ.
વિવિધ ઉત્પાદકોએ સુસંગતતાના અનુસંધાનમાં કેટલાક પ્રયાસો પણ કર્યા છે.ઉદાહરણ તરીકે, મોટાભાગની કંપનીઓએ હવે વેચાણ માટે પ્રમાણભૂત કીટ તરીકે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પેકેજ કર્યું છે, જે એક સારી પસંદગી છે.
ઉદાહરણ તરીકે, ફોરજીનની આરટી ઇઝી સિરીઝ કિટ્સ:

RT Easy I (પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ cDNA સિન્થેસિસ કીટ માટે માસ્ટર પ્રિમિક્સ)

MIQE (5) - લક્ષ્ય જનીન માહિતી

ઉપરનો આંકડો સમજાવે છે
1. આ જનીન પુનરાવર્તિત પ્રયોગો માટે અસરકારક છે કે કેમ તે સામાન્ય રીતે પુનરાવર્તિત પ્રયોગો દ્વારા ચકાસી શકાય છે.
2. જીન આઈડી, તમે જાણો છો.
3. જનીન લંબાઈ, લક્ષ્ય જનીનની કુલ લંબાઈ ચોક્કસપણે કોઈ સમસ્યા નથી.પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરતી વખતે, ખાતરી કરો કે એમ્પ્લીકોનની લંબાઈ 80-200bp ની વચ્ચે છે જેથી વધુ સારી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સુનિશ્ચિત થાય.
4. સિક્વન્સ બ્લાસ્ટ સરખામણીની માહિતી, બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનને રોકવા માટે જીનબેંકમાં લક્ષ્ય જનીનની સરખામણી કરવાની જરૂર છે.
5. સ્યુડોજેન્સની હાજરી.સ્યુડોજીન એ સામાન્ય જનીન જેવો જ ડીએનએ ક્રમ છે પરંતુ તેનું સામાન્ય કાર્ય ગુમાવે છે.તે યુકેરીયોટ્સના મલ્ટી-જીન પરિવારમાં ઘણીવાર અસ્તિત્વ ધરાવે છે.તે સામાન્ય રીતે ψ દ્વારા દર્શાવવામાં આવે છે.તે જીનોમમાં બિન-કાર્યકારી જીનોમિક ડીએનએ નકલ છે જે કોડિંગ જનીન ક્રમ સાથે ખૂબ સમાન છે., સામાન્ય રીતે ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવામાં આવતા નથી, અને તેનો કોઈ સ્પષ્ટ શારીરિક અર્થ નથી.
6. એક્સોન્સ અને ઇન્ટ્રોનની તુલનામાં પ્રાઇમર્સની સ્થિતિ.શરૂઆતના વર્ષોમાં, જ્યારે અમે DNA દૂષણની સમસ્યાનું નિરાકરણ કર્યું, ત્યારે અમે ઘણીવાર પ્રાઇમર્સ, એક્સોન્સ અને ઇન્ટ્રોન્સની સ્થિતિ પર ધ્યાન આપ્યું અને સામાન્ય રીતે DNA એમ્પ્લીફિકેશન ટાળવા માટે ઇન્ટ્રોન્સમાં પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરવાનું માનવામાં આવતું હતું.કૃપા કરીને નીચેની આકૃતિ જુઓ: કાળો રંગ ઇન્ટ્રોન્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, વિવિધ બ્લૂઝ એક્સોન્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, ગુલાબી સામાન્ય પ્રાઇમર્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, અને તેજસ્વી લાલ ઇન્ટ્રોન-સ્પૅનિંગ પ્રાઇમર્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.

યોજનાકીય, ક્યારેય સાચું નથી
આ કેટલી સંપૂર્ણ યોજના લાગે છે, પરંતુ વાસ્તવમાં, મોટાભાગના કિસ્સાઓમાં, ટ્રાન્સ-ઇન્ટ્રોન પ્રાઈમર્સ કલ્પનાના જેટલા જાદુઈ નથી, અને તે બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનું કારણ પણ બનશે.તેથી ડીએનએ દૂષણને રોકવાનો શ્રેષ્ઠ માર્ગ એ છે કે ડીએનએને સંપૂર્ણપણે દૂર કરવું.
7. રચનાની આગાહી.આ ઉદાહરણનો ફરીથી ઉપયોગ કરીને, ચોક્કસ તાપમાન અને મીઠાની સાંદ્રતા પર લક્ષ્ય ટુકડાની ગૌણ રચના નક્કી કરવા માટે mFold ઓનલાઈન ટૂલનો ઉપયોગ કરો.

વિવિધ તાપમાને આરએનએનું ગૌણ માળખું
ગૌણ માળખું એ ટેમ્પલેટની જ પૂરક જોડી છે, જે પ્રાઈમર અને ટેમ્પલેટ જોડી વચ્ચે મજબૂત સ્પર્ધા તરફ દોરી જશે, અને પ્રાઈમર બાઈન્ડિંગની શક્યતાઓ ઓછી છે, પરિણામે ઓછી E અને નબળી પુનરાવર્તિતતા જેવી સમસ્યાઓની શ્રેણીમાં પરિણમે છે.સોફ્ટવેર અનુમાન દ્વારા, જો ત્યાં કોઈ ગૌણ માળખું સમસ્યા નથી, તો તે મહાન હશે.જો ત્યાં હોય, તો અમારો ફોલો-અપ લેખ ખાસ કરીને આ સમસ્યાને કેવી રીતે હલ કરવી તેની ચર્ચા કરશે.

MIQE (6)-qPCR ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ

ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર માટે, તમે દરરોજ જેની સાથે સંઘર્ષ કરો છો તે પ્રથમ વસ્તુ આરએનએ નિષ્કર્ષણ છે, અને બીજી વસ્તુ પ્રાઈમર ડિઝાઇન હોઈ શકે છે.
સૌ પ્રથમ, અમે હજી પણ MIQE ચેકલિસ્ટ અનુસાર પ્રાઈમર ડિઝાઇન વિશેના નિયમો તપાસીએ છીએ.તે એટલું સરળ છે કે સ્કેમ્બેગ્સ હસી શકે છે, અને અમે તેને એક વાક્યમાં સમાપ્ત કરી શકીએ છીએ: પ્રાઈમર પ્રોબનો ક્રમ અને સ્થિતિ અને ફેરફારની પદ્ધતિ શોધો.પ્રાઈમર શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિ માટે, પ્રાઈમર સંશ્લેષણ હાલમાં ખૂબ સસ્તું છે, qPCR એ PAGE અને ઉપરની શુદ્ધિકરણ પદ્ધતિઓ માટે યોગ્ય છે, અને સંશ્લેષણ સાધનની માહિતી મહત્વપૂર્ણ નથી.ઘણા લોકો દાયકાઓથી પ્રાઈમર કરી રહ્યા છે અને તેઓ જાણતા નથી કે સિન્થેસાઈઝર ABI3900 છે.
પ્રાઈમર ડિઝાઇનના સિદ્ધાંતો વિશે, તમારે તેને રોટ દ્વારા યાદ રાખવાની જરૂર નથી, કારણ કે મોટાભાગના પ્રાઈમર ડિઝાઇન સોફ્ટવેર અથવા ઓનલાઈન ટૂલ્સ આ સમસ્યાઓનું ધ્યાન રાખી શકે છે (ભલામણ કરેલ ઓનલાઈન ટૂલ primer3.ut.ee/), અને 99.999% પ્રાઈમર ડિઝાઈન મેન્યુઅલી કરવામાં આવતી નથી, જુઓ, લેખક કેટલીકવાર દિવસમાં સેંકડો પ્રાઈમર ડિઝાઇન કરે છે, જો તમે તેને એક પછી એક વાંચશો, તો તે વધશે.
પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કર્યા પછી ફક્ત નીચેના મુદ્દાઓ તપાસો:
1. 3′ છેડાની નજીકના પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરો: cDNA ફર્સ્ટ-સ્ટ્રૅન્ડ સિન્થેસિસ માટે ઓલિગો ડીટી પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરવાના કિસ્સામાં, રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા અને RNA અખંડિતતાને ધ્યાનમાં રાખીને, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સુધારવા માટે ડિઝાઇન કરેલા પ્રાઇમર્સને 3′ છેડાની નજીક ડિઝાઇન કરવાની જરૂર છે.નીચે પ્રમાણે સમજાવવા માટે ચિત્રનો ઉપયોગ કરો (આ સમજવાની કોઈ રીત નથી):

શા માટે પ્રાઇમર્સ 3′ છેડાની નજીક ડિઝાઇન કરવા જોઈએ, તે સાચું ન હોવું જોઈએ
2. TM મૂલ્ય: Tm મૂલ્ય 55-65°C પર છે (કારણ કે exonuclease પ્રવૃત્તિ 60°C પર સૌથી વધુ છે), અને GC સામગ્રી 40%-60% છે.
3. બ્લાસ્ટ: જીનોમના બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનને ટાળવા માટે, પૂરક ચકાસણી માટે બ્લાસ્ટનો ઉપયોગ કરવો આવશ્યક છે.

MIQE(7)-qPCR પ્રક્રિયા

1. qPCR કીટ
MIQE ની જરૂરિયાતો અનુસાર, અમારે લેખમાં PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીનું રૂપરેખાંકન, કઈ કીટનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, ઉત્પાદક કોણ છે, પ્રતિક્રિયા સિસ્ટમ કેટલી મોટી છે, શું રંગ પદ્ધતિ અથવા ચકાસણી પદ્ધતિનો ઉપયોગ થાય છે, PCR પ્રોગ્રામ સેટિંગ્સ સહિતની સંપૂર્ણ પ્રતિક્રિયાની સ્થિતિનું સ્પષ્ટ વર્ણન કરવું જોઈએ.વેટરન ડ્રાઇવરો ચોક્કસપણે જોશે કે જ્યાં સુધી કીટ પસંદ કરવામાં આવે ત્યાં સુધી ઉપરોક્ત માહિતી મૂળભૂત રીતે નક્કી કરવામાં આવે છે.
હાલમાં, ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર કીટનું ઉત્પાદન અને ઉત્પાદન ખૂબ જ પરિપક્વ તકનીક છે.જ્યાં સુધી તમે અત્યંત ખરાબ ઉત્પાદકોને પસંદ ન કરો ત્યાં સુધી, સમસ્યાઓની સંભાવના વધારે નથી, પરંતુ અમે હજુ પણ તમારી સાથે થોડા મુદ્દાઓ શેર કરવા માંગીએ છીએ:
હોટ-સ્ટાર્ટ Taq એન્ઝાઇમ:પીસીઆરનો સૌથી મહત્વપૂર્ણ ભાગ હોટ-સ્ટાર્ટ ટાક એન્ઝાઇમ છે.બજારમાં હોટ-સ્ટાર્ટ એન્ઝાઇમને સામાન્ય રીતે બે પ્રકારમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે, એક રાસાયણિક રીતે સંશોધિત હોટ-સ્ટાર્ટ એન્ઝાઇમ છે (તમે તેને પેરાફિન એમ્બેડિંગ તરીકે કલ્પના કરી શકો છો), અને બીજું એન્ટિબોડી ફેરફાર (એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી બંધનકર્તા) માટે હોટ-સ્ટાર્ટ એન્ઝાઇમ છે.રાસાયણિક ફેરફાર એ ગરમ-પ્રારંભિક ઉત્સેચકોનો પ્રારંભિક માર્ગ છે.જ્યારે ચોક્કસ તાપમાન પહોંચી જાય છે, ત્યારે એન્ઝાઇમ તેની પ્રવૃત્તિને મુક્ત કરશે.એન્ટિબોડી-સંશોધિત હોટ-સ્ટાર્ટ એન્ઝાઇમ એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને અવરોધિત કરવા માટે જૈવિક પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરે છે.જ્યારે ચોક્કસ તાપમાન પહોંચી જાય છે, ત્યારે એન્ટિબોડી વિકૃત થઈ જશે અને પ્રોટીન તરીકે નિષ્ક્રિય થઈ જશે, અને એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને અમલમાં લાવવામાં આવશે.

જો કે, આનો ઉપયોગ શું છે?આ કેસ છે, રાસાયણિક રીતે સંશોધિત ઉત્સેચકો કરતાં એન્ટિબોડી-સંશોધિત ઉત્સેચકોની પ્રકાશન પ્રવૃત્તિ ઝડપી છે, તેથી સંવેદનશીલતાની દ્રષ્ટિએ, એન્ટિબોડી-સંશોધિત ઉત્સેચકોનો થોડો ફાયદો છે, જેથી બજારમાં કિટ્સમાં મૂળભૂત રીતે કોઈ રાસાયણિક રીતે સંશોધિત ઉત્સેચકો નથી.જો ત્યાં છે, તો પછી આ ઉત્પાદકની તકનીક હજી પણ સહસ્ત્રાબ્દીના યુગમાં અટવાયેલી છે.
મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતા:પીસીઆર પ્રતિક્રિયામાં મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતા ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.યોગ્ય મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતા Taq એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિના પ્રકાશનને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે.જો સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડવામાં આવશે;જો એકાગ્રતા ખૂબ ઊંચી હોય, તો એન્ઝાઇમ-ઉત્પ્રેરિત બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન વધારવામાં આવશે.મેગ્નેશિયમ આયનોની સાંદ્રતા પ્રાઈમર્સના એનિલિંગ, ટેમ્પલેટના ગલન તાપમાન અને પીસીઆર ઉત્પાદનોને પણ અસર કરશે, જેનાથી એમ્પ્લીફાઈડ ટુકડાઓની ઉપજને અસર થશે.મેગ્નેશિયમ આયનોની સાંદ્રતા સામાન્ય રીતે 25mM પર નિયંત્રિત થાય છે.અલબત્ત, સારી કીટ માટે, મેગ્નેશિયમ આયનોની સાંદ્રતા સારી રીતે નિયંત્રિત હોવી જોઈએ.કેટલાક વેપારીઓ રીએજન્ટમાં મેગ્નેશિયમ આયન ચેલેટીંગ એજન્ટ ઉમેરે છે, જે મેગ્નેશિયમ આયન સાંદ્રતાના સ્વચાલિત ગોઠવણની અસર પ્રાપ્ત કરી શકે છે.
ફ્લોરોસન્ટ ડાય એકાગ્રતા:ફ્લોરોસન્ટ ડાઈ, જે SYBR ગ્રીન છે જેનો આપણે સામાન્ય રીતે ઉપયોગ કરીએ છીએ, મુખ્યત્વે ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએના નાના ગ્રુવ સાથે જોડાઈને ફ્લોરોસેન્સ ઉત્પન્ન કરે છે, કારણ કે ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ સાથે ડાઈનું બંધન બિન-વિશિષ્ટ છે, એટલે કે જ્યાં સુધી ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ છે, ત્યાં સુધી તે ડીએનએ સાથે સંયોજિત થઈ શકે છે. સિસ્ટમ તેની સાથે જોડાઈને બેકગ્રાઉન્ડ સિગ્નલ બનાવશે.
PS: તેના પ્રકાશ-સંવેદનશીલ ગુણધર્મોને લીધે, બજારમાં ઉત્પાદનો સામાન્ય રીતે બ્રાઉન અપારદર્શક સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં પેક કરવામાં આવે છે (નીચે ચિત્રમાં બતાવ્યા પ્રમાણે).જો કે, આ સમસ્યાનો સામનો કરશે.નમૂના લેતી વખતે પ્રવાહી ચૂસવામાં આવે છે કે કેમ તે જોવું મુશ્કેલ છે.આ સંદર્ભમાં, કિન્ગકે ખરેખર સૌથી વધુ વપરાશકર્તા મૈત્રીપૂર્ણ છે (નીચે ચિત્રમાં બતાવ્યા પ્રમાણે), અને પારદર્શક ટ્યુબને અપારદર્શક ટીન બેગમાં પેક કરવામાં આવે છે.પછી પ્રકાશને ટાળવાની અને નમૂના લેવાની સગવડને ધ્યાનમાં રાખીને તેને ટીન બેગમાં મૂકો.તમારે યોગ્ય ઉત્પાદન નંબર પસંદ કરવો આવશ્યક છે.TSE204 એક સુપર ખર્ચ-અસરકારક અસ્તિત્વ છે, જે મને ઘાસ રોપવા માંગે છે.

ફ્લોરોસન્ટ રંગની સાંદ્રતા પણ ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.જો સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તો પછીના તબક્કામાં એમ્પ્લીફિકેશન કર્વ ઉપર જશે નહીં અને તે સંપૂર્ણ નથી;જો સાંદ્રતા ખૂબ ઊંચી હોય, તો તે અવાજની દખલનું કારણ બનશે.ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર મુખ્યત્વે CT મૂલ્ય પર આધારિત હોવાથી, જો ફ્લોરોસન્ટ રંગની સાંદ્રતા યોગ્ય રીતે ગોઠવવામાં આવતી નથી, તો નીચું બિંદુ ઉચ્ચ બિંદુ કરતાં વધુ સારું છે.અલબત્ત, યોગ્ય રંગની સાંદ્રતા શ્રેષ્ઠ છે.

ROX: ROX રંગોનો ઉપયોગ સારી-થી-સારી ફ્લોરોસેન્સ સિગ્નલ ભૂલોને સુધારવા માટે થાય છે.કેટલાક ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ ઉત્પાદકોને માપાંકનની જરૂર છે, જ્યારે અન્ય નથી.ઉદાહરણ તરીકે, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિકના રિયલ ટાઈમ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન ઈન્સ્ટ્રુમેન્ટના ઉપયોગ માટે સામાન્ય રીતે કેલિબ્રેશનની જરૂર પડે છે, જેમાં 7300, 7500, 7500ફાસ્ટ, સ્ટેપવનપ્લસ વગેરેનો સમાવેશ થાય છે. સામાન્ય કીટ સૂચનાઓ તેનું વર્ણન કરશે.
ફોરજીનના qPCR મિક્સમાં ROX ડાઇ પણ હોય છે, જે વિવિધ મોડલ્સમાં વાપરવા માટે અનુકૂળ છે.

રીઅલ ટાઇમ પીસીઆર કિટ-તકમાન

નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડ સારવાર: નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડની સારવાર એ પ્રમાણમાં તકનીકી બાબત છે.કોઈએ ઘણી કીટની મેન્યુઅલ વાંચી નથી, પરંતુ તેમાંથી કોઈએ આ વિષયનો ઉલ્લેખ કર્યો નથી.હકીકતમાં, તે ખૂબ જ મહત્વપૂર્ણ છે.પાયાનું સંયોજન મુખ્યત્વે હાઇડ્રોજન બોન્ડની મજબૂતાઈ પર આધારિત છે.મજબૂત હાઇડ્રોજન બોન્ડ સામાન્ય એમ્પ્લીફિકેશન છે, અને નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન તરફ દોરી જાય છે.જો નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડને સારી રીતે દૂર કરી શકાતા નથી, તો બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ટાળી શકાય નહીં.લેખકના અવકાશમાં, માત્ર થોડી કંપનીઓએ આ સમસ્યાને ધ્યાનમાં લીધી છે.જ્યારે તમે કિટ ખરીદો છો, ત્યારે તમે જે કિટ પસંદ કરવા માંગો છો તેના માટે તમે આ સંદર્ભમાં કોઈ ઉકેલ વિચાર્યું છે કે કેમ તેનો સંદર્ભ લઈ શકો છો.

પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમ: 20-50ul સિસ્ટમનો વધુ ઉપયોગ થાય છે, અને નાના વોલ્યુમમાં ભૂલો થવાની સંભાવના છે.સામાન્ય રીતે કહીએ તો, કીટની સૂચનાઓ પીસીઆર પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમોના ઉપયોગની ભલામણ કરશે.સ્માર્ટ બનો નહીં અને ખર્ચ બચાવવા માટે નાના વોલ્યુમનો ઉપયોગ કરો.નો ધ્યેય.વેપારીઓ દ્વારા ભલામણ કરવામાં આવેલ વોલ્યુમનું વાસ્તવમાં પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું છે અને એવું બની શકે છે કે તેઓ નાના વોલ્યુમોને કારણે થતી ભૂલોની સમસ્યાને હલ કરી શકતા નથી.
2. ટ્યુબ પ્લેટનો ઉત્પાદક અને લેખ નંબર
ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆરના સિદ્ધાંતને દરેક વ્યક્તિ જાણે છે.ફ્લોરોસેન્સ સંગ્રહ મુખ્યત્વે પીસીઆર ટ્યુબ કેપ્સ દ્વારા હાથ ધરવામાં આવે છે.પીસીઆર ઉપભોજ્ય વસ્તુઓ પસંદ કરતી વખતે, બે મુદ્દાઓ પર ધ્યાન આપો: સારું પ્રકાશ ટ્રાન્સમિશન અને સાધન માટે યોગ્ય.સામાન્ય રીતે કહીએ તો, મુખ્ય પ્રવાહની બ્રાન્ડ્સના બોર્ડ અને ટ્યુબ સરસ છે, પરંતુ તમારે અનુકૂલનની દ્રષ્ટિએ કાળજીપૂર્વક પસંદ કરવું પડશે, અન્યથા તમે સાધનનો ઉપયોગ કરી શકશો નહીં.

4. ટોચના સ્તરનું જ્ઞાન

MIQE (8)-qPCR માન્યતા
આ qPCR ની ટોચની પ્રાથમિકતા છે!ઘણા હીરો અહીં રેતીમાં પડ્યા છે.અલબત્ત, એ પણ શક્ય છે કે તમે નસીબદાર છો અને તમે જે જીન્સનો અભ્યાસ કર્યો છે તે સરળ છે, તેથી તમે પવનની સાથે બરફની ગુફામાંથી તરતા હતા.qPCR ની ચકાસણી માહિતીનો હેતુ ડેટાની વિશ્વસનીયતા ચકાસવા માટે છે.અમે જરૂરી ચકાસણી માહિતીને નીચે પ્રમાણે સૂચિબદ્ધ કરીએ છીએ:

1.વિશિષ્ટતા પરીક્ષણ
ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ ચિત્ર સિંગલ બેન્ડ છે કે કેમ તે ચકાસીને લક્ષ્ય જનીન એમ્પ્લીફિકેશનની વિશિષ્ટતા ચકાસવામાં આવે છે;ક્રમની ચકાસણી;પીક મેપ સિંગલ છે કે કેમ તે જોવા માટે ગલન કર્વ;એન્ઝાઇમ પાચન ચકાસણી અને અન્ય પદ્ધતિઓ.
અહીં, અમે ટી પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરીએ છીએતે ગલન વણાંકોની પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનું વિશ્લેષણ કરે છે.સામાન્ય રીતે કહીએ તો, જ્યારે આપણે પ્રાઇમર્સ ડિઝાઇન કરીએ છીએ, ત્યારે ઉત્પાદનના ટુકડાનું કદ 80-200bpની રેન્જમાં હોવું જરૂરી છે, જે PCR ઉત્પાદનના ગલન તાપમાનને 80-85 °C રેન્જમાં બનાવે છે.તેથી, જો ત્યાં પરચુરણ શિખરો હોય, તો ત્યાં અન્ય બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદનો હોવા જોઈએ;જો શિખર 80°C થી નીચે દેખાય, તો તેને સામાન્ય રીતે પ્રાઈમર ડિમર ગણવામાં આવે છે;જો શિખર 85°C થી ઉપર દેખાય, તો તેને સામાન્ય રીતે DNA દૂષણ અથવા મોટા ટુકડાઓનું વધુ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન માનવામાં આવે છે.
નોંધ: કેટલીકવાર 80°C પર માત્ર એક જ શિખર હોય છે.આ સમયે, આ ખ્યાલનું પાલન કરવું આવશ્યક છે.સંભવ છે કે એમ્પ્લીફિકેશન પરિણામો તમામ પ્રાઈમર ડાયમર છે.

સામાન્ય ગલન વળાંક (કોઈ બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન વિના એક શિખર)

સમસ્યારૂપ ગલન વળાંક (બનાવટી શિખરોનું બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન)
【કેસ વિશ્લેષણ】

ત્યાં એક મુખ્ય શિખર છે, પરંતુ પ્રાઈમર ડિમર ગંભીર છે
નીચેની આકૃતિમાં સિંગલ-પીક મેલ્ટિંગ કર્વ તમારી આંખોને સરળતાથી છેતરી શકે છે, એવું વિચારીને કે તે એક સંપૂર્ણ પ્રયોગ છે, પરંતુ પરિણામ સંપૂર્ણપણે ખોટું છે.આ સમયે, આપણે ગલન તાપમાનને જોવું પડશે.ટોચનું તાપમાન 80°C ની નીચે છે, જે સંપૂર્ણપણે પ્રાઈમર-ડાઈમર છે.

કોઈ લક્ષ્ય ટુકડો નથી, બધા પ્રાઈમર ડાયમર્સ
અહીં, મારો ભાઈ રોકી શકતો નથી.નીચેનો ફોટો મને એક બદમાશ દ્વારા મોકલવામાં આવેલ મોબાઈલ ફોન વડે લેવાયેલ ફોટો છે.તેણે જે રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ કર્યો તે તમામ ઉદ્યોગમાં સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી બ્રાન્ડ્સ છે.તે એક ટી-પ્રીફિક્સ બ્રાન્ડથી બીજા ટી-પ્રીફિક્સ બ્રાન્ડમાં બદલાઈ ગયો.મને લાગે છે કે તમે પહેલેથી જ અનુમાન લગાવ્યું છે.બદમાશ મને રડ્યો: “પ્રથમ ચિત્રમાં વપરાયેલ રીએજન્ટ ખૂબ સારું છે, અને ટોચ સિંગલ છે.પાછળથી, તમે ભલામણ કરેલ રીએજન્ટનો ઉપયોગ કર્યા પછી, તે મિશ્ર શિખરો સાથે બીજા ચિત્ર જેવું બને છે.તમે મને દુ:ખી કરી છે."
બે ગ્રાફને અલગ કરો.પ્રથમ નજરમાં, એકમાં એક શિખર છે, અને બીજામાં ડબલ શિખર છે.નોનસેન્સ, એક શિખર અલબત્ત સારું છે.શું તે સાચું છે?
Dou E કરતાં ખરાબ, જો હું નીચે ચિત્રમાં બે ચિત્રો મૂકીશ, તો તમે તરત જ સમજી શકશો.વાસ્તવમાં, આ પ્રકારના ચિત્રથી આપણે સરળતાથી લકવાગ્રસ્ત થઈ જઈએ છીએ.કાળજીપૂર્વક વિશ્લેષણ કર્યા પછી, અમને જાણવા મળ્યું કે: પ્રથમ આકૃતિની ટોચ 75°C પર છે, જે સંપૂર્ણપણે પ્રાઈમર ડિમર છે;બીજા આંકડાની ટોચ 75°C અને 82°C પર દેખાય છે, ઓછામાં ઓછા ત્યાં ઉત્પાદન દેખાય છે.

વિદ્યાર્થીઓના પ્રતિભાવના ચિત્રો
તેથી મૂળભૂત સમસ્યા રીએજન્ટની સમસ્યા નથી, પરંતુ પ્રાઈમર ડિઝાઇનની સમસ્યા છે.તે જ સમયે, તે એ પણ સાબિત કરે છે કે કેટલીક મોટી બ્રાન્ડ્સ આયર્ન ગુણવત્તાની નથી, અને તે એ પણ સાબિત કરે છે કે મારા ભાઈએ પહેલા શું કહ્યું હતું: તે રીએજન્ટ બ્રાન્ડ નથી જે તમારા લેખને સમર્થન આપે છે.તે તમારો લેખ છે જેણે રીએજન્ટ્સની બ્રાન્ડને આગળ ધપાવ્યો છે.જરા કલ્પના કરો, જો બદમાશોએ રીએજન્ટ્સ ન બદલ્યા હોય, તો ખોટો ડેટા જર્નલમાં મોકલવામાં આવશે, અને શું થશે તે એક દુર્ઘટના હશે.
2. ખાલી નિયંત્રણનું Ct મૂલ્ય
સમજાવશો નહીં, જો ખાલી નિયંત્રણમાં Ct મૂલ્ય હોય, તો શું તે પ્રદૂષણ નથી?જો કે, તમારે હજુ પણ સમજવાની જરૂર છે કે કયા ખાલી નિયંત્રણમાં Ct મૂલ્ય છે.જો તે NTC છે, તો તેનો અર્થ એ છે કે ત્યાં વિદેશી ડીએનએ છે જેમ કે રીએજન્ટ દૂષણ.જો તે NRT છે, તો તેનો અર્થ એ છે કે કાઢવામાં આવેલ RNAમાં DNA દૂષણ છે.
3. પ્રમાણભૂત વળાંક
ઢાળ અને ગણતરી સૂત્ર સહિત, PCR કાર્યક્ષમતા સૂત્ર દ્વારા ગણતરી કરી શકાય છે.એક સંપૂર્ણ પ્રયોગ માટે 3.32 સુધી પહોંચવા માટે પ્રમાણભૂત વળાંકનો ઢોળાવ અને 0.9999 સુધી પહોંચવા માટે R² જરૂરી છે.
4. રેખીય ગતિશીલ શ્રેણી
પ્રતિક્રિયાની ગતિશીલ શ્રેણી રેખીય છે.સ્ટાન્ડર્ડ કર્વ જનરેટ કરવા માટે વપરાતા ટેમ્પ્લેટ મુજબ, ડાયનેમિક રેન્જમાં ઓછામાં ઓછા 5 એકાગ્રતા ગ્રેડિયન્ટ્સનો સમાવેશ થવો જોઈએ, અને ઉચ્ચ સાંદ્રતા ગ્રેડિએન્ટ્સ અને નીચા એકાગ્રતા ગ્રેડિએન્ટ્સ પર Ct મૂલ્યોના ફેરફાર પર ધ્યાન આપવું જોઈએ.
5. તપાસ ચોકસાઈ
qPCR પરિણામોમાં ફેરફારો, એટલે કે, નબળી પુનરાવર્તિતતા, એટલે કે નબળી ચોકસાઇ, તાપમાન, એકાગ્રતા અને કામગીરી સહિતના ઘણા પરિબળોને કારણે થાય છે.qPCR ચોકસાઇ સામાન્ય રીતે ઓછી નિયંત્રણક્ષમ બને છે કારણ કે કૉપિ નંબર ઘટે છે.પ્રાયોગિક ભિન્નતામાં આદર્શ રીતે, આ તકનીકી વિવિધતા જૈવિક વિવિધતાથી અલગ હોવી જોઈએ, અને જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ જૂથો અથવા સારવારો વચ્ચેના qPCR પરિણામોમાં આંકડાકીય તફાવતોને સીધી રીતે સંબોધિત કરી શકે છે.ખાસ કરીને ડાયગ્નોસ્ટિક એસેસ માટે, સાઇટ્સ અને ઓપરેટરોમાં શ્રેષ્ઠ આંતર-મૂલ્યાંકન ચોકસાઇ (પુનરાવર્તિતતા)ની જાણ કરવી આવશ્યક છે.
6. તપાસ કાર્યક્ષમતા અને LOD (મલ્ટીપ્લેક્સ qPCR માં)
LOD એ 95% પોઝિટિવ સેમ્પલની સૌથી ઓછી સાંદ્રતા છે.બીજા શબ્દોમાં કહીએ તો, લક્ષ્ય જનીન પ્રતિકૃતિઓના સમૂહમાં સમાયેલ LOD ની સાંદ્રતા નિષ્ફળ પ્રતિક્રિયાઓના 5% કરતા વધુ ન હોવી જોઈએ.મલ્ટિપ્લેક્સ qPCR વિશ્લેષણ કરતી વખતે, ખાસ કરીને બિંદુ પરિવર્તન અથવા પોલીમોર્ફિઝમની એક સાથે શોધ માટે, મલ્ટિપ્લેક્સ qPCR એ પુરાવા પ્રદાન કરવાની જરૂર છે કે એક જ ટ્યુબમાં બહુવિધ લક્ષ્ય ટુકડાઓની ચોકસાઈ સાથે ચેડા નથી, બહુવિધ શોધ અને સિંગલ ટ્યુબ શોધ કાર્યક્ષમતા અને LOD સમાન હોવા જોઈએ.ખાસ કરીને જ્યારે ઉચ્ચ એકાગ્રતાના લક્ષ્ય જનીનો અને ઓછી સાંદ્રતાના લક્ષ્ય જનીનોને એકસાથે વિસ્તૃત કરવામાં આવે છે, ત્યારે આ સમસ્યા પર ધ્યાન આપવું આવશ્યક છે.
સમસ્યાઓ અને ઉકેલોસામાન્ય રીતે કહીએ તો, qPCR ડિબગીંગમાં વારંવાર આવતી સમસ્યાઓ નીચેના પાસાઓ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરે છે:
બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન
પ્રાઈમર સાંદ્રતાની મુશ્કેલ પસંદગી અને પ્રાઈમર-ડાઈમર સાથે મુશ્કેલી
એન્નીલિંગ તાપમાન અચોક્કસ છે
· ગૌણ માળખું એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અસર કરે છે
બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન
બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનથાય છે, તે સામાન્ય રીતે ધ્યાનમાં લેવામાં આવે છે કે શું પ્રાઈમર ડિઝાઇન યોગ્ય નથી, પરંતુ જો તમે પ્રાઇમર્સ બદલવાની ઉતાવળમાં ન હોવ, તો તમે પહેલા નીચેની પદ્ધતિઓ અજમાવી શકો છો (સિદ્ધાંત પણ જોડાયેલ છે):
· એનિલિંગ તાપમાનમાં વધારો - નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડને જાળવવામાં અસમર્થ બનાવવાનો પ્રયાસ કરો;
એન્નીલિંગ અને લંબાવવાનો સમય ટૂંકો કરો - નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડની શક્યતા ઘટાડે છે;
· પ્રાઈમરની સાંદ્રતામાં ઘટાડો - રીડન્ડન્ટ પ્રાઇમર્સ અને બિન-લક્ષ્ય વિસ્તારોને બાંધવાની તક ઘટાડે છે;
ઓછી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા
બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનની વિપરીત પરિસ્થિતિ - નીચી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા અને નીચી એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સાથે કામ કરવાનાં પગલાં તદ્દન વિપરીત છે:
એન્નીલિંગ અને લંબાવવાનો સમય લંબાવવો;
થ્રી-સ્ટેપ પીસીઆરમાં બદલો અને એનિલિંગ તાપમાન ઘટાડવું;
પ્રાઇમર સાંદ્રતા વધારો;
Ps: 90 ના દાયકામાં જન્મેલા ઘણા સ્નાતક વિદ્યાર્થીઓ પ્રયોગોને કેવી રીતે ડીબગ કરવા તે અભ્યાસ કરવા તૈયાર નથી, અને આશા છે કે કીટ સમસ્યાને સંપૂર્ણપણે હલ કરી શકે છે (જો તમે સ્નાતક થયા પછી સંશોધન અને વિકાસ કરવા માટે રીએજન્ટ કંપનીમાં જવા માંગતા હોવ), વાસ્તવમાં, રીએજન્ટ ઉત્પાદકો પણ આ રીતે વિચારે છે, હું આશા રાખું છું કે તે એક મૂર્ખ છે જ્યારે તમે ઉત્પાદકોની સમસ્યાનું નિરાકરણ કરવા માટે ઘણા પ્રયત્નો કરો ત્યારે તેનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. નબળા એચ-બોન્ડ શોષણ પરિબળોનો પરિચય.સમસ્યાને સરળતાથી ઉકેલવા માટે, મૂર્ખ લોકોએ હજી પણ રીએજન્ટ કંપનીનો પરિચય વાંચવો પડશે કે શું ત્યાં કોઈ પરિબળ છે જે નબળા હાઇડ્રોજન બોન્ડને શોષી લે છે.
પ્રાઈમર સાંદ્રતાની મુશ્કેલ પસંદગી અને પ્રાઈમર-ડાઈમર સાથે મુશ્કેલી
પદ્ધતિ 1: સામાન્ય રીતે કહીએ તો, qPCR માટેની કીટની સૂચનાઓમાં સિસ્ટમની ભલામણ કરવામાં આવી છે અને પ્રાઈમર સાંદ્રતાની ભલામણ કરવામાં આવી છે.
પદ્ધતિ 2: પ્રાઈમર સાંદ્રતા ઢાળ સેટ કરીને ડીબગીંગ.સમજાવવા માટે નીચેનું ચિત્ર એક કંપનીમાંથી ચોરાયેલું છે.નીચેનો આંકડો ત્રણ પ્રાઈમર કોન્સન્ટ્રેશન ગ્રેડિયન્ટ્સ (100nM, 250nM, 500nM) અને ચાર ટેમ્પલેટ કોન્સન્ટ્રેશન ગ્રેડિએન્ટ્સ (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) સાથે બનાવેલા ફ્લોરોસેન્સ જથ્થાત્મક પરિણામો દર્શાવે છે.પ્રાયોગિક પરિણામોનું Ct મૂલ્ય નીચે પ્રમાણે રચાયેલ છે:

પ્રાઈમર કોન્સન્ટ્રેશન સિલેક્શન દરેક પ્રાઈમર કોન્સન્ટ્રેશનને નીચે પ્રમાણે એક લીટીમાં જોડો:

પ્રાઈમર સાંદ્રતાની પસંદગી સ્પષ્ટ છે, 100nM અને 250nM ની પ્રાઈમર સાંદ્રતાનો રેખીય સંબંધ વધુ સારો છે, અને 500nM ની પ્રાઈમર સાંદ્રતાનો રેખીય સંબંધ પ્રમાણમાં નબળો છે.100nM અને 250nM માં, 250nM નું Ct મૂલ્ય પ્રમાણમાં નાનું છે, તેથી શ્રેષ્ઠ પ્રાઈમર સાંદ્રતા 250nM છે.સામાન્ય રીતે ગંભીર પ્રાઈમર-ડાઈમર ગલન કર્વમાં જોઈ શકાય છે.જો ડિઝાઇન કરેલ પ્રાઇમર્સ પ્રાઇમર-ડાઇમર્સને ટાળી ન શકે તો શું?
પદ્ધતિ 3: પ્રાઇમર્સની માત્રામાં ઘટાડો અને એનિલિંગ તાપમાનમાં વધારો (સમજાવાની જરૂર નથી).
એનેલીંગ તાપમાનનું પ્રાયોગિક મૂલ્ય 60°C છે.જો તમને ખાતરી ન હોય તો, વધુ યોગ્ય એનિલિંગ તાપમાન કેવી રીતે પસંદ કરવું?જવાબ પ્રાઈમર સાંદ્રતાની પસંદગી જેવો જ છે -ગ્રેડિયન્ટ ટેસ્ટ.સમસ્યાને સમજાવવા માટે Bio-rad કંપનીમાંથી એક ચિત્ર લો.ચોક્કસ લક્ષ્ય ટુકડાના એમ્પ્લીફિકેશન માટે, આઠ તાપમાન ગ્રેડિએન્ટ્સ સેટ કરો, દરેક ત્રણ પુનરાવર્તનો સાથે, અને પ્રાપ્ત એમ્પ્લીફિકેશન વળાંક નીચે મુજબ છે:

એન્નીલિંગ તાપમાનની પસંદગી:
· 70°C, 69°C—મૂળભૂત રીતે, પ્રાઇમર્સને જોડી શકાતા નથી, તેથી ત્યાં કોઈ એમ્પ્લીફિકેશન નથી.
· 67.3°C - શરૂઆતમાં થોડી માત્રામાં એમ્પ્લીફિકેશન છે, અને Ct મૂલ્ય પ્રમાણમાં મોટું છે.
·64.5°C——Ct મૂલ્ય ઘટે છે.
· 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, અને 55.0°C પર, Ct મૂલ્યો મૂળભૂત રીતે સ્થિર હતા, પરંતુ અંતિમ ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્યો અલગ હતા.
કેવી રીતે પસંદ કરવું?સિદ્ધાંત: પ્રથમ સિદ્ધાંત ઉચ્ચ Ct મૂલ્ય છે.સમાન Ct મૂલ્ય માટે, ડાઇમરાઇઝેશન અને બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન ટાળવા માટે ઉચ્ચ એનિલિંગ તાપમાન પસંદ કરો.55°C પર ફ્લોરોસેન્સનું ઊંચું મૂલ્ય હોવા છતાં, તેમાં ડાઇમર્સ અથવા બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન હોઈ શકે છે.
પરંતુ જો તમે તમારા જેટલા સ્માર્ટ છો, તો તમે ચોક્કસપણે વિચારશો: તાર્કિક રીતે કહીએ તો, જો PCR પ્રતિક્રિયા ખૂબ જ ચોક્કસ હોય, જ્યાં સુધી પ્રાઈમર સાંદ્રતા લઘુત્તમ જરૂરિયાત કરતાં વધી જાય ત્યાં સુધી, ફ્લોરોસન્ટ રંગો અને dNTPsની જેમ, ઉચ્ચ અને નીચા બિંદુઓની કોઈ અસર થવી જોઈએ નહીં.ખરેખર, જ્યાં સુધી એનિલિંગ તાપમાન યોગ્ય રીતે ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવે ત્યાં સુધી, Ct મૂલ્ય પર પ્રાઇમર સાંદ્રતાની અસર કુદરતી રીતે ઓછી કરવામાં આવશે.

એનિલિંગ તાપમાન યોગ્ય રીતે ઑપ્ટિમાઇઝ કરવામાં આવ્યું છે, અને સીટી પર પ્રાઇમર સાંદ્રતાની અસર ઘટાડવામાં આવશે
ગૌણ માળખું એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતાને અસર કરે છે
ચાલો સમસ્યાને સમજાવવા Bio-rad માંથી ચિત્ર લઈએ.તે ગૌણ માળખું સાથે જનીનને વિસ્તૃત કરવા માટે તાપમાનના ઢાળને પણ ડિઝાઇન કરે છે.

ગૌણ માળખું બહાર આવે છે
તે જોઈ શકાય છે કે જેમ જેમ તાપમાનનો ઢાળ ઘટે છે, ઉત્પાદનો દેખાવાનું શરૂ થાય છે અને Ct મૂલ્ય આગળ વધે છે, લઘુત્તમ મૂલ્ય 60.7°C પર પહોંચે છે, અને પછી તાપમાનનો ઢાળ ઘટતો જાય છે, Ct મૂલ્ય મોટું થાય છે.તેનાથી વિપરીત, જેમ જેમ તાપમાન વધે છે, ગૌણ માળખું ખુલે છે અને એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા વધે છે.ચોક્કસ તાપમાને પહોંચ્યા પછી, તાપમાનમાં વધારો એ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતામાં સુધારો કરી શકતું નથી.કારણ કે આ સમયે પ્રાઈમર્સને સ્થિર રીતે જોડી શકાતા નથી.તેથી,સૌથી નીચા Ct મૂલ્ય સાથે તાપમાન માટે જુઓ, જે સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચર ટેમ્પલેટને એમ્પ્લીફાઈ કરવા માટે શ્રેષ્ઠ તાપમાન છે!અલબત્ત, સ્માર્ટ મૂર્ખ લોકોને ખબર હોવી જોઈએ કે જો તે જરૂરી ન હોય, તો પ્રાઇમર્સ બદલવું અને ગૌણ માળખાના પ્રદેશને ટાળવું શ્રેષ્ઠ છે.
5. એપ્લિકેશન સ્તર
MIQE - ડેટા વિશ્લેષણ

ડેટા વિશ્લેષણ મુખ્યત્વે ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક PCR સાધન દ્વારા આપવામાં આવે છે.અગાઉના લેખમાં, ડેટા વિશ્લેષણનું ઘણું કામ કરવામાં આવ્યું છે, જેમ કે ખાલી નિયંત્રણ, જે પ્રયોગની ડિઝાઇનમાં સમજાવવામાં આવ્યું છે.આંતરિક સંદર્ભ જનીનો, પુનરાવર્તિત સંખ્યાઓ વગેરેની સ્પષ્ટતા કરવામાં આવી છે., અહીં અમે મુખ્યત્વે qPCR ની અરજી સમજાવીએ છીએ.
qPCR નો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે, અને પ્રાયોગિક ચકાસણી અને ન્યુક્લીક એસિડ નિદાન એ સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા દૃશ્યો છે.
સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ
લોગ (પ્રારંભિક એકાગ્રતા) ચક્રની સંખ્યા સાથે રેખીય સંબંધ ધરાવે છે.જાણીતી પ્રારંભિક નકલ નંબર સાથેના ધોરણમાંથી પ્રમાણભૂત વળાંક દોરી શકાય છે, એટલે કે, એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાનો રેખીય સંબંધ મેળવી શકાય છે.નમૂનાના Ct મૂલ્ય અનુસાર, નમૂનામાં સાંદ્રતાની ગણતરી કરી શકાય છે.સમાવવા માટે નમૂનાઓનો જથ્થો.

સંપૂર્ણ માત્રાત્મક ગણતરી પદ્ધતિ
સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ પ્રમાણભૂત વળાંક પર આધારિત હોવું જોઈએ.પ્રમાણભૂત વળાંક બનાવવા માટે, પ્રમાણભૂત આવશ્યક છે.સામાન્ય રીતે, ધોરણ એ લક્ષ્ય જનીનનું ક્લોનિંગ કરીને મેળવવામાં આવેલ પ્લાઝમિડ છે.શા માટે તે પ્લાઝમિડ છે?કારણ કે ગોળાકાર પ્લાઝમિડ ડીએનએ સૌથી સ્થિર છે.બમણા ગુણોત્તર (10-ગણો મંદન) અનુસાર પ્રમાણભૂત ઉત્પાદનને 5 થી 6 ગ્રેડિએન્ટમાં પાતળું કરો અને પાતળું કરતી વખતે એકરૂપતા પર ધ્યાન આપો.Ct મૂલ્યને 15-30 ની વચ્ચે આવવા દો.

પ્રમાણભૂત તૈયારી
તે જ સમયે, પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાને પણ તે મુજબ પાતળું કરવું જોઈએ (મંદન પરિબળ યાદ રાખો), અને Ct મૂલ્ય પણ 15-30 ની વચ્ચે આવવું જોઈએ.પ્રમાણભૂત ઉત્પાદન + પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાને એકસાથે મશીન પર મૂકવામાં આવે છે.રન કર્યા પછી, પ્રમાણભૂત પદાર્થ સાથે પ્રમાણભૂત વળાંક બનાવવામાં આવ્યો હતો, અને એકાગ્રતાની ગણતરી કરવા માટે પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાઓને પ્રમાણભૂત વળાંકમાં લાવવામાં આવ્યા હતા.
હેપેટાઇટિસ બી વાયરસ HBV પ્રમાણીકરણ એ એક વિશિષ્ટ સંપૂર્ણ પરિમાણ છે, જે રક્તના 1ml માં વાયરસ નકલ નંબરની ગણતરી કરી શકે છે.
નકલ નંબરની ગણતરી
પરીક્ષણ કરવા માટે નમૂનાની સાંદ્રતા (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × મંદન પરિબળ
નમૂના પરમાણુ વજન = પાયાની સંખ્યા × 324
ચકાસવા માટેના નમૂનાની નકલ નંબર (કૉપીઝ/ઉલ) = પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાની સાંદ્રતા / નમૂનાનું પરમાણુ વજન × 6 × 1014

નકલ નંબરની ગણતરી પદ્ધતિ

ઉપરોક્ત જથ્થો નક્કી કરવા માટેની ગણતરી પદ્ધતિ છે.આ એક ગાણિતિક સમસ્યા છે જે જુનિયર હાઈસ્કૂલમાંથી સ્નાતક થયા પછી ઉકેલી શકાય છે, અને ગાણિતિક સમસ્યાઓ સામાન્ય રીતે કોમ્પ્યુટર દ્વારા ઉકેલવામાં આવે છે.જો તમે સમજી શકતા નથી, તો તમે વાતચીત કરવા આવી શકો છો.
સંબંધિત પરિમાણ
સાપેક્ષ પ્રમાણીકરણનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે વૈજ્ઞાનિક સંશોધનમાં થાય છે.1ml લોહીમાં કેટલા વાઈરસ છે, અને તે DNA વાયરસ છે, આ પ્રમાણમાં નિર્ધારિત ઘટના છે: લોહીની માત્રા નક્કી કરી શકાય છે, અને DNA વાયરસ પ્રમાણમાં સ્થિર છે.જો કે, અમારા માટે પાનમાં ચોક્કસ જનીનની ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન નકલોની સંખ્યાની સરખામણી કરવી મુશ્કેલ છે, કારણ કે પાંદડાનું કદ, વજન અને કોમળતા નક્કી કરવી મુશ્કેલ છે, કાઢવામાં આવેલ આરએનએની માત્રા નક્કી કરવી મુશ્કેલ છે, અને રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શનની કાર્યક્ષમતા પણ નક્કી કરવી મુશ્કેલ છે, એટલે કે, કોઈપણ પગલાથી પ્રાયોગિક ડેટાનો ઉપયોગ કરી શકાતો નથી.
તેથી, સંબંધિત પરિમાણમાં એક તત્વ રજૂ કરવું આવશ્યક છે:આંતરિક સંદર્ભ જનીન.
બીજા શબ્દોમાં કહીએ તો, સાપેક્ષ પ્રમાણીકરણ એ ખરેખર લક્ષ્ય જનીન અને આંતરિક સંદર્ભ જનીન વચ્ચેની સરખામણી છે.સમાન પેશીઓ અને સમાન કોષની તુલનામાં, નમૂનાના કદનો પ્રભાવ, આરએનએ નિષ્કર્ષણની રકમ, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કાર્યક્ષમતા અને પીસીઆર કાર્યક્ષમતા પ્રમાણમાં ઓછી છે.નાના નમૂનાના કદને કારણે, બંને આંતરિક સંદર્ભ જનીનો અને લક્ષ્ય જનીનો પ્રમાણમાં ઓછા થયા હતા.આ જ કારણ છે કે અમે પહેલા એકરૂપતા અને સ્થિરતા પર ભાર મૂકતા આવ્યા છીએ.
આંતરિક સંદર્ભ જનીનો સામાન્ય રીતે છેહાઉસકીપિંગ જીન્સ(હાઉસ-કીપિંગ જીન્સ), જે તમામ કોષોમાં સ્થિર રીતે વ્યક્ત થયેલા જનીનોના વર્ગનો સંદર્ભ આપે છે અને કોષોની મૂળભૂત જીવન પ્રવૃત્તિઓ જાળવવા માટે તેમના ઉત્પાદનો જરૂરી છે.
આ ખ્યાલને ગૂંચવશો નહીં.હાઉસકીપિંગ જીન્સ એ જૈવિક કાર્યના શબ્દો છે, જ્યારે આંતરિક સંદર્ભ જનીનો પ્રાયોગિક તકનીકી શબ્દો છે.હાઉસકીપિંગ જનીનોને આંતરિક સંદર્ભ જનીનો તરીકે પસંદ કરી શકાય તે પહેલાં માન્યતા પાસ કરવી જરૂરી છે.
ઉદાહરણ તરીકે, અમે વિવિધ પેશી કોશિકાઓમાં તેમના અભિવ્યક્તિ સ્તરને ચકાસવા માટે નીચેની આકૃતિમાં કેટલાક હાઉસકીપિંગ જનીનો પસંદ કર્યા, અને જાણવા મળ્યું કે β-2-માઈક્રોગ્લોબ્યુલિનના અભિવ્યક્તિ સ્તર અન્ય ત્રણ જનીનો કરતાં તદ્દન અલગ હતા, તેથી તેઓ આંતરિક સંદર્ભ જનીનો તરીકે ઉપયોગ કરી શકતા નથી.

આંતરિક સંદર્ભ જનીનની સુધારણા કાર્યને સમજ્યા પછી, આંતરિક સંદર્ભ જનીનની રજૂઆતને કારણે બે અલ્ગોરિધમ્સ પ્રાપ્ત થાય છે.
· ડબલ પ્રમાણભૂત વળાંક પદ્ધતિ
·2 – △△Ct પદ્ધતિ (CT મૂલ્ય સરખામણી પદ્ધતિ)
જો તમે પ્રજાતિઓ અને જનીન કાર્યોનો અભ્યાસ કરવામાં રસ ધરાવો છો, તો કૃપા કરીને અલ્ગોરિધમ્સ પર સંશોધન છોડી દો અને સીધા જ સૂત્રોનો ઉપયોગ કરો અથવા મશીનોનો સીધો ઉપયોગ કરો;જો તમે ગણિત અને એન્જિનિયરિંગમાં સીધા વ્યક્તિ છો, તો કૃપા કરીને નિઃસંકોચ.
ડબલ સ્ટાન્ડર્ડ વળાંક પદ્ધતિ
નિયંત્રણ નમૂનાના લક્ષ્ય જનીન અને હાઉસકીપિંગ જનીન અને પ્રમાણભૂત વળાંક દ્વારા પરીક્ષણ કરવાના નમૂનાનું પ્રમાણ નક્કી કરો અને પછી ગણતરીના સૂત્ર અનુસાર સંબંધિત મૂલ્યની ગણતરી કરો, જે સંબંધિત અભિવ્યક્તિ સ્તર છે.
ફાયદા: સરળ વિશ્લેષણ, પ્રમાણમાં સરળ પ્રાયોગિક ઑપ્ટિમાઇઝેશન
ગેરલાભ: દરેક જનીન માટે, પ્રયોગોના દરેક રાઉન્ડમાં પ્રમાણભૂત વળાંક હોવો આવશ્યક છે
એપ્લિકેશન: જનીન અભિવ્યક્તિ નિયમનના અભ્યાસમાં બે સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી અને માન્ય સંબંધિત માત્રાત્મક પદ્ધતિઓમાંથી એક
સૂત્ર નીચે મુજબ છે.

ઉદાહરણો નીચે મુજબ છે.

માત્રાત્મક પરિણામના આધારે સંબંધિત રકમની ગણતરી કરો
2 – △△Ct પદ્ધતિ (CT મૂલ્ય સરખામણી પદ્ધતિ)

ફાયદા: પ્રમાણભૂત વળાંક બનાવવાની જરૂર નથી
ગેરફાયદા: એવું માનવામાં આવે છે કે એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 100% ની નજીક છે;પ્રમાણભૂત વિચલન < 5% છે, અને પ્રમાણભૂત વળાંક અને દરેક એમ્પ્લીફિકેશન વચ્ચેની કાર્યક્ષમતા સુસંગત હોવાનું માનવામાં આવે છે;પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓનું ઑપ્ટિમાઇઝેશન વધુ જટિલ છે.
એપ્લિકેશન: જનીન અભિવ્યક્તિ નિયમનના અભ્યાસમાં બે સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી અને માન્ય સંબંધિત માત્રાત્મક પદ્ધતિઓમાંથી એક

અલબત્ત, એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા સામાન્ય રીતે સંપૂર્ણ રીતે અશક્ય છે 1. સુધારણા પદ્ધતિ: જો આપણે જાણીએ છીએ કે લક્ષ્ય જનીન અને સંદર્ભ જનીન સમાન એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા ધરાવે છે, પરંતુ એમ્પ્લીફિકેશન કાર્યક્ષમતા 1 ની બરાબર નથી, તો 2－△△Ct આ રીતે સુધારી શકાય છે: (1+C, amplification ઉદાહરણ માટે 1+E) 0.95 છે, તો ગણતરીના સૂત્રને 1.95－△△Ct પર સુધારી શકાય છે.
અત્યાર સુધી, ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર વિશેની સામગ્રી સમાપ્ત થઈ ગઈ છે.